一种基于拉曼光谱的直接免疫测定法检测特定抗原

首先将拉曼报告染料分子与金纳米颗粒共同孵育，使报告分子结合到纳米颗粒上。

加入聚乙二醇（PEG）及针对目标抗原的PEG偶联抗体。抗体通过金-二硫键与纳米颗粒共价结合。加入巯基偶联的PEG以封闭纳米颗粒的剩余位点，防止纳米颗粒聚集，从而形成纳米颗粒探针。

用目标抗原包被免疫测定板孔。使用含蛋白质的溶液封闭板上的其余位点。加入纳米颗粒探针。在各孔中对探针进行系列稀释。孵育，使探针中的抗体与抗原结合，形成复合物。

使用拉曼显微镜测定探针的光学响应。入射的单色激光激发金纳米颗粒表面的电子并引起其振荡，从而在探针表面产生强的局部电磁场。

入射光束与拉曼报告分子相互作用，由于增强的电磁场，导致产生具有不同波长和频率的增强非弹性光或拉曼散射。这种非弹性发射的拉曼信号被用于生成拉曼光谱。

绘制拉曼报告分子峰的光谱面积与探针浓度的关系曲线，以确定探针检测的下限，并促进对抗原更灵敏的检测。

为了制备拉曼探针，首先制备两份1.5毫升的金纳米颗粒和拉曼报告分子，其浓度根据随附文本方案中的描述确定。

通过将拉曼报告分子溶液与金纳米颗粒溶液混合，并在室温下孵育30分钟使其结合。然后，向其中一份已结合报告分子的金纳米颗粒溶液中加入聚乙二醇化抗体溶液，使抗体与颗粒的比例为200:1。该溶液将用于检测样本。

在另一个微量离心管中，按抗原与颗粒200:1的比例，将聚乙二醇化抗原加入另一种与报告分子结合的金纳米颗粒溶液中，作为对照。将两种溶液在室温下孵育30分钟。

接下来，封闭纳米颗粒表面的剩余位点。为此，首先使用高效液相色谱用水将固体甲氧基聚乙二醇硫醇溶解至200微摩尔浓度。涡旋振荡溶液直至硫醇完全溶解。然后，按40,000:1的比例将硫醇溶液加入连接有PEG-抗体的纳米颗粒溶液中，并在室温下孵育10分钟，以确保金纳米颗粒上的剩余位点被充分封闭。

接下来，将颗粒在低吸附离心管中离心，以回收功能化的拉曼探针，直至上清液澄清。用移液器小心吸走上清液，注意不要扰动纳米颗粒。然后，用 1 毫升 PBS 重新悬浮纳米颗粒。

通过取约三微升溶液进行紫外-可见光谱测定，估算金纳米颗粒的浓度，并将结果与已知浓度的金纳米颗粒测定结果进行比较，因为二者呈线性关系。

如果纳米颗粒未得到充分封闭，由于颗粒间的黏附力作用，它们将发生聚集，这表明试剂的添加浓度不正确。正常情况下，溶液呈深红色，而聚集则会导致溶液呈现灰色。

调整体积，使最终溶液的浓度至少达到每毫升1 × 10¹¹个颗粒，并将溶液在4摄氏度下保存，直至用于免疫测定板的功能化。这些溶液应在一周内使用完毕。首先，配制足量的稀释抗原以填充聚苯乙烯微孔。然后，涡旋振荡溶液，并立即将其加入到微孔板的孔中。

室温下孵育1小时，使抗原结合到板上。然后倾去多余的抗原溶液，并将板轻轻撞击于铺有纸巾的台面上以去除残留液体。向孔中加入TBST洗涤液清洗表面。随后再次倾去洗涤液，并将板轻轻撞击于铺有纸巾的台面上以去除残留洗涤液。

接下来，向板的每孔中加入70微升HSA封闭液，以封闭板上剩余的结合位点，防止非特异性结合，并将板在室温下孵育30分钟。然后，移除封闭液，并用TBST洗涤板三次，操作方式如前所述。最后一次洗涤液移除后，盖好板并干燥保存于4摄氏度，直至后续使用。

将先前制备的探针纳米颗粒140微升加入96孔板的第一列，前五排加入待测纳米颗粒，后三排加入对照纳米颗粒。向其余各列加入70微升PBS。

使用1比2的连续稀释法稀释每一列。首先从第一列取70微升，与第二列混合。然后从第二列取70微升加入第三列，依此类推。让培养板孵育至少一小时。

然后，去除未结合的纳米粒子探针，并用 TBST 洗涤平板，共洗涤五次，方法如前所述。最后一次洗涤后，向每个孔中加入 70 µL PBS，并用封板膜覆盖平板。检查对照样品是否澄清。如果发生非特异性结合，对照样品将呈现与检测样品相似的颜色。

使用倒置拉曼显微镜，将物镜聚焦于含有金纳米粒子探针的孔板表面。获取该孔板的拉曼光谱。采集波数范围从1800 cm⁻¹到400 cm⁻¹的光谱，并对每个孔板重复此操作。最后，按照随附文本方案最后一节中的步骤，确定该装置的灵敏度。