研究靶向化学物质作用的肥大细胞脱颗粒实验

肥大细胞——一种特化的白细胞，含有丰富的分泌颗粒，其中富含溶酶体酶，例如β-己糖胺酶。

为了进行肥大细胞脱颗粒——这一过程涉及分泌颗粒的释放，首先准备一个含经免疫球蛋白预处理的小鼠腹腔肥大细胞悬液的多孔板。

用目标化学物质处理细胞。具有刺激潜能的目标化学物质会与肥大细胞特异性受体上预先结合的免疫球蛋白相互作用。这会激活含有β-己糖胺酶的颗粒向细胞表面移动，并将其释放到溶液中。

离心培养板以沉淀细胞，并将含有酶的上清液转移至新培养板的空孔中。用裂解缓冲液处理细胞沉淀，以裂解细胞并释放其内容物至裂解液中，包括细胞内的β-己糖胺酶。

将含有酶的裂解液加入同一块多孔板的另一个孔中。用酶的底物对两个孔进行处理，即对硝基苯基-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺，并进行孵育。酶会水解底物，释放出对硝基苯酚——一种有色产物，可使溶液变为黄色。

加入碱性终止液覆盖孔板，以终止反应并将对硝基苯酚转化为对硝基苯酚盐，从而增强黄色显色。在405纳米波长下，通过分光光度法测定两个孔中溶液的吸光度。

计算酶释放的百分比，该百分比与靶化学物质对肥大细胞脱颗粒的刺激作用相关。

为检测β-己糖胺酶的释放，将每孔100微升的细胞悬液转移至96孔V型底培养板中。向每孔加入25微升刺激液或对照溶液。随后，在37摄氏度下孵育细胞45分钟。之后，将96孔板置于冰上5分钟以终止反应。然后，在4摄氏度下以120 g 离心4分钟。

将120微升上清液转移至平底96孔板中，并置于冰上。操作时需小心避免触碰细胞沉淀，但应完全吸走上清液。接着，向细胞沉淀中加入125微升裂解缓冲液。室温孵育细胞沉淀5分钟，孵育结束后通过反复吹打重悬细胞。

在新的平底96孔板的所需孔中，加入25微升4毫摩尔的pNAG溶液。分别向已准备好的pNAG溶液中加入25微升每种上清液和25微升每种细胞裂解液。在37摄氏度下孵育反应体系1小时。孵育结束后，向每个孔中加入150微升终止液以终止反应。

接下来，使用酶标仪在405纳米波长下检测平板样品的光吸收值，并以630纳米为参考波长进行自动背景扣除。在采集程序中，勾选“参考”选项，并在“吸光度”程序元素菜单中选择“630 纳米”，以实现自动背景扣除。