小鼠库普弗细胞的分离与培养

库普弗细胞是定位于肝窦内的常驻巨噬细胞，有助于保护肝脏免受感染。

为了分离小鼠库普弗细胞，取一个 freshly harvested perfused 小鼠肝脏放入含有培养基的培养皿中。用胶原酶进行肝脏灌注的步骤可消化细胞外基质，导致肝细胞解离。

撕裂肝包膜以释放解离的肝细胞，包括实质细胞、PCs以及非实质细胞（NPCs），后者包含库普弗细胞、内皮细胞、星状细胞和残余的红细胞。

过滤以去除碎片。对滤液进行低速差速离心，选择性沉淀PCs。收集含有NPC的上清液。离心以浓缩细胞。

将细胞重悬于培养基中，并铺加到由两种不同密度的等渗密度梯度介质组成的非连续密度梯度上。通过离心，细胞根据其密度与梯度介质的相对关系而分离。

收集梯度层界面处富集的NPC层，转移至含有培养基的离心管中并离心。将重悬后的NPC接种至多孔板中。

几分钟内，悬浮液中的库普弗细胞会迅速黏附到塑料孔板表面，而其他非实质细胞（NPC）则保留在培养基中。更换为新鲜培养基以维持库普弗细胞的生长。

为了纯化库普弗细胞，将一个灌注过的肝脏放入含有15毫升库普弗细胞分离培养基的培养皿中。使用剪刀或镊子撕破格利森氏囊，将所有肝细胞释放到培养基中。将溶液通过100微米细胞筛过滤至离心管中。随后，将细胞悬液在4摄氏度下以50 g 离心2分钟。

实质细胞将位于沉淀中，而非实质细胞将位于上清液中。将上清液收集至洁净的离心管中，在50 g条件下离心2分钟。重复此步骤，共进行4次转移和离心。

接下来，将上清液在1,350 g 离心15分钟，以沉淀非实质细胞。弃去上清液，并将沉淀物重悬于10毫升Kupffer细胞分离培养基中。将非实质细胞悬液加入先前根据文本方案制备的25/50%等渗不连续密度梯度液中，在无加速度和无刹车条件下于850 g 离心15分钟。

使用10毫升血清移液管，吸取约12毫升富集的库普弗细胞组分，该组分位于25% SIP层靠近25/50% SIP界面处，呈浑浊状。将细胞转移至含有35至40毫升库普弗细胞分离培养基的离心管中，轻轻混匀。随后，在1,350 g 条件下4摄氏度离心，以沉淀细胞。

弃去上清液，加入5至10毫升预热的培养基重悬细胞。使用血细胞计数板计数细胞，并用台盼蓝染色检测细胞活力。将纯化的非实质细胞以每孔5 × 10⁵个细胞的密度接种于24孔板中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟，然后轻轻移除培养基。

使用预热的 HBSS 清洗细胞，并加入 500 微升/孔新鲜预热的库普弗细胞培养基。