利用机械解离法从小鼠背根神经节中分离巨噬细胞

背根神经节（DRG）是沿脊髓分布的一簇神经元胞体，负责将感觉信息从外周神经系统传递到中枢神经系统。外周神经损伤可导致巨噬细胞在DRG中聚集，并引发神经病理性疼痛。

为了使用无酶方法分离有活力的巨噬细胞，将新鲜解剖的小鼠背根神经节（DRG）组织放入含有冰冻缓冲液的匀浆器中，以限制细胞应激。使用研杵对组织进行机械匀浆，以释放细胞。

通过细胞滤网过滤，以去除细胞团块，并在滤液中获得单细胞悬液。组织匀浆物中含有神经元和非神经元细胞，后者包括巨噬细胞和游离的髓鞘——即神经元的绝缘鞘。

将过滤后的匀浆加入含有密度梯度介质的离心管中，进行离心。在离心力作用下，具有较高浮力密度的活细胞沉降至管底形成沉淀，而髓鞘则保持悬浮状态。弃去上清液。

将细胞重悬于含有荧光染料偶联的巨噬细胞特异性细胞表面受体抗体的缓冲液中，孵育所需时间。抗体与其在巨噬细胞表面的受体结合，从而对细胞表面进行荧光标记。洗涤以去除未结合的抗体。

使用流式细胞仪分析细胞。特异性抗体的荧光信号表明样本中存在巨噬细胞。

实验开始前，将9体积的密度梯度介质与1体积不含钙和镁的10倍浓度HBSS混合，配制成工作液，并置于冰上保存。通过轻捏后肢足垫无反应来确认小鼠已完全麻醉。

首先将一只麻醉后的小鼠仰卧置于化学通风橱内，并用胶带固定四肢。用镊子提起肋骨下方的皮肤，再用手术剪做一个小切口，以暴露肝脏和膈肌。用同一把手术剪剪开膈肌和肋骨，然后打开胸膜腔，暴露出跳动的心脏。

接着，使用虹膜剪迅速剪开右心耳。观察到出血后，将一根30号针头插入左心室后端，缓慢注入10毫升预冷的1×PBS溶液，以灌注动物。

进行背侧椎板切除术时，将小鼠置于俯卧位。使用11号手术刀从胸段开始沿两侧做两个纵向深部切口，一直延伸至骶段。随后，去除皮肤以暴露背侧肌肉层。接着，用Friedman-Pearson咬骨钳剥离结缔组织和肌肉，直至暴露出腰骶部脊柱棘突及双侧横突。

首先，使用 Friedman-Pearson 咬骨钳小心地打开背侧脊柱。然后，在 Friedman-Pearson 咬骨钳和 Noyes 弹簧剪之间交替使用，以去除椎骨，暴露带有完整附着脊神经的脊髓。仔细分离同侧和对侧腰段背根神经节（DRG）。

将组织放入含有1毫升预冷的无钙、无镁1×HBSS的Dounce组织匀浆器中。使用松动的研杵在Dounce匀浆器中匀浆DRG组织20至25次。将一个无菌的70微米尼龙细胞筛置于一个无菌的50毫升锥形管上。用800微升预冷的1×HBSS润湿细胞筛。

使用移液器将匀浆器中的匀浆组织悬液转移至湿润的细胞滤筛上，并收集到50毫升锥形管中。用800微升预冷的1×HBSS冲洗匀浆器两次，将冲洗液收集至同一50毫升锥形管中，以提高得率。

向一个无菌的5毫升聚苯乙烯FACS管中加入1.5毫升预冷至冰温的等渗密度梯度介质。将细胞匀浆从50毫升锥形管转移至该FACS管中，并用移液器上下吹打充分混匀。

加入额外的 500 微升 1× HBSS 以封闭上层。在 4 摄氏度下以 800 × g 离心 20 分钟。小心吸除含有培养基中髓鞘的上清液，避免扰动管底的细胞沉淀。

向沉淀中加入含有5%胎牛血清的100微升PBS，重悬DRG细胞。然后向细胞中加入α-小鼠CX3CR1-APC抗体，在4°C避光孵育1小时。

用 5 毫升 PBS 洗涤细胞一次。在 360 × g 条件下离心细胞 g 在4摄氏度下离心8分钟。吸除上清液，然后将细胞沉淀重悬于300微升PBS中，用于FACS分析。