从小鼠派伊尔集合淋巴结中分离淋巴细胞

派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是小肠壁内组织化的淋巴组织聚集，包含B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞等免疫细胞。

为了从小鼠派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中分离淋巴细胞，首先对小鼠实施安乐死。切开腹壁，暴露腹腔。找到盲肠，解剖回盲交界处，将盲肠与小肠分离。

切除肠系膜，并在十二指肠处切开小肠，以将小肠从腹腔中取出。将小肠置于含有冷培养基的多孔板中，并冲洗以去除碎片。

将小肠放置于肠系膜面朝下的位置，并用培养基润湿以维持组织的水分。在肠壁对侧肠系膜面识别派伊尔结（Peyer's patches, PPs）——呈白色多叶状聚集的结构。

小心切除集合淋巴结（PPs），避免周围肠组织。转移至含有培养基的离心管中。在持续振荡条件下孵育。此振荡步骤可使黏液、细胞碎片及任何粪便物质从PPs上脱落，从而提高PP淋巴细胞的回收率。

接下来，将组织转移至具有合适孔径的细胞筛中。轻柔地分散派伊尔结（Peyer's patches）并释放细胞。用培养基冲洗细胞筛，以获得单细胞淋巴细胞悬液。在低温条件下离心该悬液，以维持细胞稳定性。

用培养基重悬淋巴细胞，并用于后续分析。

首先将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇对腹部进行消毒。从耻骨至肋缘沿中线切开皮肤和腹膜，暴露腹腔，找到盲肠及回盲交界处。

在尽可能远端的位置进行切割，于小肠与盲肠交界处切断，并用剪刀剪开肠系膜，小心移除从该处至幽门括约肌的整个小肠。

剪断幽门与十二指肠之间的连接处，将小肠完全从腹腔中分离，并将分离出的小肠置于含有冰冷 RPMI 培养基的六孔板的一个孔中，培养基中需添加 10% 胎牛血清（FBS），并置于冰上。然后，手动轻轻振荡组织，直至所有肠段均浸没于冷培养基中。

当所有肠道组织采集完毕后，用镊子夹住肠道一端的肠系膜脂肪，并将样本——肠系膜面朝下——放置在纸巾上。用含10%胎牛血清的RPMI润湿整个肠段，以防止组织脱水和粘连，并在肠壁对侧（非肠系膜侧）寻找派伊尔结，其表现为白色多叶状、形似花椰菜的聚集结构。

为收获派伊尔结，使用弯头手术剪（弯头朝上），从每个派伊尔结的远端和近端边缘轻轻将其切除，注意避免包含周围肠组织，并在收集过程中将派伊尔结置于含有冰冻RPMI加10% FBS的12孔板的各个孔中，置于冰上。

当获取所有派尔集合淋巴结后，使用剪刀剪去1毫升微量移液器吸头的尖端，使其直径足够大，能够吸取单个派尔集合淋巴结，并将派尔集合淋巴结转移至每只小鼠对应的150毫升锥形管中，每管含有25毫升37摄氏度的RPMI培养基，添加10%胎牛血清（FBS）。

然后，将试管置于37摄氏度的摇床中，以125至150 RPM持续振荡10分钟。振荡结束后，将每只小鼠的派伊尔结转移至140微米细胞筛上，并使用每只动物对应的110毫升注射器活塞的橡胶端，轻轻将派伊尔结通过筛网压入各自的50毫升锥形管中。

用 15 至 20 毫升冷的 RPMI 加 10% FBS 冲洗滤网，并通过离心收集细胞。小心弃去上清液后，将细胞重新悬浮于 RPMI 加 10% FBS 中，浓度约为 1 × 10⁷ 个细胞/毫升，用于计数。然后，将每 200 微升培养基中含有 2 至 2.5 × 10⁶ 个细胞的悬液转移至 96 孔圆底板的每个孔中，并通过离心形成细胞沉淀。