从共同淋巴样前体细胞体外生成浆细胞样树突状细胞

浆细胞样树突状细胞（pDCs）是一类通过产生I型干扰素来应对感染的免疫细胞。

生成 pDCs 体外取从小鼠骨髓中分离的常见淋巴样祖细胞（common lymphoid progenitor cells，CLPs）悬液。CLPs 可分化为淋巴细胞和树突状细胞。

将细胞悬液加入经γ射线照射以抑制增殖的饲养细胞层——贴壁的基质细胞上。饲养细胞可提供CLP分化所需的细胞因子和细胞间接触。

加入适量浓度的Fms样酪氨酸激酶3配体（FL）——一种促进浆细胞样树突状细胞（pDC）发育的二价细胞因子，并进行孵育。

CLPs 在饲养细胞之间迁移并增殖，形成称为铺路石样区域的细胞簇。

培养基中的FL与CLP上的Flt3受体（一种酪氨酸激酶受体）结合。这种结合可诱导受体二聚化，并引起胞内区酪氨酸残基的自磷酸化。

细胞质接头蛋白会结合这些残基并被磷酸化，将信号传递给下游信号组分。该信号级联反应促使共同淋巴样前体细胞（CLPs）分化为浆细胞样树突状细胞（pDCs）——即悬浮生长的小型圆形细胞——以及传统树突状细胞（cDCs）——即体积较大、呈纺锤形并贴壁生长的细胞。

收集细胞。加入针对pDC和cDC特异性表面标志物的抗体。使用流式细胞术分析细胞。

表达pDC特异性标志物且不表达cDC特异性标志物的细胞，表明pDC发育成功。

为了通过流式细胞术分析常见的淋巴样祖细胞（CLPs），接下来使用抗CD16/32抗体对细胞进行F_c阻断，时间为一到两分钟，随后用适当的抗体混合物对细胞进行同步染色。

冰浴15分钟后，用3毫升FACS缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于300微升新鲜FACS缓冲液中。随后，将细胞悬液通过40微米滤网过滤，并立即在流式细胞仪上使用适当的滤光片和电压进行分选，将目标细胞收集至含有8毫升完全RPMI培养基的15毫升离心管中。

为了获得高度富集的pDC群体，关键是从收获的骨髓细胞中分选出正确的CLP群体，并用于与AC-6饲养系统共培养。

分选结束后，离心收集细胞，并用足量的完全RPMI培养基重悬CLP细胞沉淀，使细胞密度约为每毫升5 × 10⁴个细胞。随后，将每孔500个细胞接种至含有AC-6饲养层细胞的12孔板中，并在共培养体系中添加100 ng/mL FLT3配体。然后，将细胞置于37°C、5% CO₂条件下培养，并定期在显微镜下观察树突状细胞（DC）的发育情况。

第12天，收集共培养上清液中的细胞，用0.5毫升完全RPMI培养基将每孔洗涤一次，合并所得的上清液和洗涤液。然后，向每孔加入0.5毫升新鲜培养基，使用细胞刮刀刮下贴壁细胞。将刮下的贴壁细胞与悬浮细胞合并，离心所得细胞悬液，并将沉淀重悬于50微升FACS缓冲液中。

然后，计数细胞，并在进行 F_c 封闭后，对 CD11c、CD11b 和 B220 表达进行染色，操作方法如前所述。随后可分析共培养细胞中是否存在传统的 CD11c 阳性、CD11b 阳性、B220 阴性树突状细胞群体，以及浆细胞样 CD11c 阳性、CD11b 阴性、B220 阳性树突状细胞群体。