基于流式细胞术的循环B细胞亚群分选

根据其细胞表面受体，人类外周血B细胞可分为CD19阳性的初始B细胞、CD19和CD27阳性的记忆B细胞，以及CD19、CD27和CD38阳性的浆母细胞和浆细胞。

为了分选这些细胞群体，取纯化的B细胞悬液，与人免疫球蛋白G抗体孵育。这些抗体可阻断B细胞的Fc受体，防止非特异性抗体结合。

加入针对 CD19、CD27 和 CD38 的荧光标记抗体。

抗CD19抗体与B细胞上普遍表达的CD19受体结合。

抗CD27抗体与记忆B细胞和浆母细胞浆细胞表面表达的CD27受体结合。

抗CD38抗体与浆母细胞和浆细胞表面表达的CD38受体结合。

加入荧光DNA结合染料作为死细胞标记物。

死细胞表现出细胞膜完整性的丧失，使得染料能够进入细胞并与双链DNA结合；而活细胞则保持不被染色。

离心以去除未结合的抗体和染料，并将细胞重悬于FACS缓冲液中。通过滤网过滤细胞，以获得均一的单细胞悬液并去除细胞团块。

使用流式细胞仪将死细胞与活细胞分选开来。在活细胞中，CD19、CD27 和 CD38 的表达可区分初始 B 细胞、记忆 B 细胞以及浆母细胞/浆细胞。

完成非特异性封闭后，将每 1 × 10⁶ 个细胞加入 1 微克的各筛选抗体，轻轻混匀，在冰上孵育 30 分钟。孵育的最后 5 分钟内，向细胞中加入 5 微升 7-AAD。然后向细胞中加入 2 毫升新鲜 PBS，涡旋混匀后离心。

将沉淀重悬于新鲜分选缓冲液中，浓度为每毫升1至5×10⁷个细胞，然后通过40微米细胞滤网过滤至新的5毫升聚苯乙烯管中。随后，通过流式细胞术将细胞分选至三个含有5毫升新鲜RPMI培养基的15毫升离心管中，以分别收集初始B细胞、记忆B细胞和浆母细胞/浆细胞。