利用ELISpot实验对抗体分泌B细胞进行功能评估

分泌抗体的B细胞，即ASCs，是已分化的B细胞，可分泌包括IgG和IgM在内的抗体同种型，从而确保机体对病原体的防护。

对ASCs进行功能评估 体外首先进行酶联免疫斑点试验。取一个底部带有活化聚偏二氟乙烯膜的ELISpot板。

将孔板与仅包含 Fab 区域而不含抗体 Fc 区域的多克隆抗体片段共同孵育。每个 Fab 区域均具有针对特定抗体同种型（IgG 或 IgM）的结合位点，从而能够识别这两种同种型。

孵育期间，抗体片段会结合到膜上，从而实现固定化。

加入封闭液以覆盖各孔，防止非特异性结合。将活化的抗体分泌型B细胞接种至板内，并进行孵育。抗体分泌细胞（ASC）会分泌包括IgG和IgM在内的不同同种型抗体，这些抗体会与膜结合的抗体片段结合。

用缓冲液洗涤平板，以去除未结合的分泌型抗体。将部分孔加入酶标记的IgM检测抗体，另一些孔加入IgG检测抗体，孵育。

检测抗体与其相应的同型结合，形成免疫复合物。

向所有孔中加入显色底物，这些底物与酶相互作用并在膜上产生紫色斑点。加入终止液以终止反应。

每个孔中产生的有色斑点表明特异性抗体的同种型存在，与B细胞的分泌活性相关。

当所有细胞收获完毕后，将细胞亚群以每毫升1至10 × 10⁵个细胞的浓度，接种于12孔细胞培养板的各个孔中，培养基为新鲜的RPMI培养基。接着，在细胞培养箱中，每孔每1 × 10⁶个细胞加入5微克CpG（ODN 2006）激活B细胞，持续培养五天。

激活结束后，在 ELISpot 板的每孔中加入 30 微升含 35% 乙醇的蒸馏水，作用 30 秒。然后将每孔中的乙醇替换为 150 微升经高压灭菌的双蒸水，在室温下孵育 5 分钟以去除残留乙醇。用 PBS 洗涤一次，随后向每孔中加入 50 微升抗人 Ig 的多克隆 F(ab')2 片段。

用 PBS 洗涤平板两次，方法如上所述。在室温下，用 200 微升含 BSA 的新鲜 PBS 处理各孔，封闭非特异性结合，孵育 2 小时。再次进行 PBS 洗涤后，将各孔加入 100 微升新鲜 RPMI 1640 培养基，在 37 摄氏度孵育。然后，将 ELISpot 各孔中的培养基更换为适当数量的活化 B 细胞。

用新鲜的RPMI培养基将每孔的终体积补至150微升。然后将ELISpot板放回细胞培养箱中孵育8至14小时。孵育结束后，弃去培养基，并用200微升含Tween 20的PBS溶液洗涤各孔，共洗涤5次，每次3分钟。

最后一次洗涤后，向各孔中加入相应的检测抗体，避光孵育两小时。再次进行 PBS 洗涤后，每孔加入 50 µL BCIP/NBT 底物，在室温下反应 5 至 15 分钟。

当出现紫色斑点时，每孔加入100微升双蒸水终止反应，并用流动的自来水冲洗反应板。然后将ELISpot膜避光空气干燥。