从小鼠胫骨中分离和培养骨髓基质细胞

骨髓基质细胞（BMSCs）是骨骼组织谱系的前体细胞，与包括造血干细胞（HSCs）和分化血细胞在内的多种细胞群体共同存在于骨髓腔中。

为了分离骨髓间充质干细胞（BMSCs），首先取新鲜收获的小鼠胫骨。切除骨的近端和远端以暴露骨髓腔。将截断的骨置于含有培养基的改良微量离心管中。

高速离心，以将骨髓从骨组织中冲出，并在离心管底部形成骨髓沉淀。从离心管中取出骨组织。使用连接在注射器上的针头反复吹打骨髓，以打散细胞团块。

向悬浮液中加入培养基。使用适当孔径的细胞筛过滤，以去除骨碎片。将含有骨髓细胞的滤液接种至塑料培养板中。

在适宜时间孵育过程中，骨髓间充质干细胞（BMSCs）会贴附于塑料培养板底部并增殖，而造血干细胞（HSCs）等非贴壁细胞则保持悬浮状态。

弃去含有非贴壁细胞的培养基。使用胰蛋白酶将骨髓间充质干细胞（BMSCs）从培养皿上消化下来。加入含血清的培养基以终止胰蛋白酶消化作用。离心后弃去上清液。

将骨髓间充质干细胞（BMSCs）重悬于新鲜培养基中，并接种至培养板。孵育，使BMSCs贴壁并形成单层细胞。

当收集完所有骨骼后，将样本置于冰上的 PBS 中，并转移至无菌培养罩内。采用无菌操作技术，在每根骨骼的近端和远端分别做 1 至 2 毫米的切口，然后将三根骨骼放入每个微量离心管中的改良微量移液器吸头内。

通过离心从骨骼中收集骨髓，确认在离心结束时骨髓已完全沉淀至各微量离心管底部。若所有骨髓均已收集，骨骼将呈现白色。将移液器吸头和骨骼从收集管中取出，并按照生物安全规范进行妥善处理。

接种骨髓细胞时，首先使用带有25号针头的1毫升注射器缓慢重悬沉淀，以打散任何团块，并将样品汇集至一个15毫升锥形管中。每500微升样品加入10毫升骨髓干细胞培养基，然后将细胞悬液通过70微米滤膜过滤至50毫升锥形管中，以去除任何骨碎片。

为了接种分裂的骨髓细胞群体培养物，将一只小鼠收获的骨髓细胞接种于一个10厘米的细胞培养皿中，在细胞培养孵育箱中用新鲜培养基培养48小时。

培养的第二天，移除含有非贴壁造血干细胞的上清液，并用 PBS 轻轻洗涤培养板，注意不要扰动已贴壁的骨髓细胞。弃去 PBS 后加入 0.25% 胰蛋白酶。在 37 摄氏度作用 1 至 3 分钟后，加入新鲜细胞培养基终止反应，并对所得的细胞悬液进行细胞计数。

将适量细胞离心后，用足量新鲜培养基重悬沉淀，以达到所需的接种密度。然后将培养板放入细胞培养箱中，直至细胞融合。