一种体外分化巨核细胞及形成血小板的方法

巨核细胞是产生血小板的大型多核细胞，而血小板对于血液凝固至关重要。

生成血小板 体外取来源于人脐带血的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）悬浮培养物。

加入血小板生成素，并在生理条件下孵育。血小板生成素与其在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）上的受体结合，触发一系列信号事件，从而促使HSPCs分化为未成熟的巨核细胞。

未成熟的细胞经过成熟过程形成成熟的巨核细胞。成熟的细胞体积较大，含有胞质分泌颗粒。它们具有多叶状的多倍体细胞核以及胞质内的内陷膜系统。

成熟的巨核细胞产生细长的细胞质突起——前血小板。前血小板由多个血小板大小的膨大结构通过细长的细胞质桥连接而成，并释放到培养基中。

胞质桥断裂，导致单个血小板释放。离心以获得血小板沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于含有二磷酸腺苷（用于血小板激活）和荧光标记抗体（用于识别激活的血小板）的缓冲液中。

二磷酸腺苷与血小板上的特异性G蛋白偶联受体结合。该结合启动信号级联反应，导致血小板活化。活化诱导细胞内信号传导，激活血小板膜上的整合素复合物。荧光标记的抗体与活化的复合物结合。

使用流式细胞术分析细胞。特异性抗体的荧光信号表明血小板已被激活。

进行巨核细胞分化时，将每毫升5 × 10⁵个CD34阳性细胞接种于12孔板中，每孔加入2毫升无血清培养基，并添加重组人血小板生成素，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中孵育。

在适当的分化监测时间点，从每个时间点的两到三个孔中收集细胞，注意不要扰动其他孔中的细胞，并使用抗CD41和抗CD42a抗体对收集的细胞进行染色，以确定培养物中成熟巨核细胞所占的百分比。

为了在显微镜下观察细胞表面标志物，用1毫升分离缓冲液洗涤收集的细胞，并将细胞沉淀重悬于100微升新鲜缓冲液中。使用细胞离心涂片机将细胞接种至载玻片上，并将载玻片浸入甲醇中30秒以固定细胞。待空气干燥后，加入20微升含DAPI的封片剂对细胞进行染色，盖上盖玻片，用于荧光显微镜观察。

为了计数前血小板，于分化第8或第9天收获细胞，并将收集的细胞以每200微升新鲜无血清培养基中含1 × 10⁴个细胞的密度接种至48孔板中，每孔培养基中均补充重组人血小板生成素。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养5天后，使用倒置光学显微镜在10倍或20倍物镜下计数每孔中带有前血小板的巨核细胞数量。

为了分析血小板活化情况，在培养的第14或15天，用巴斯德吸管轻轻混匀细胞，收集100微升细胞。向细胞中加入1毫升Tyrode's缓冲液，通过离心形成沉淀。收集上清液并进行离心，以沉淀血小板大小的颗粒，然后将这些颗粒重悬于100微升新鲜的Tyrode's缓冲液中。随后，用抗PAC-1抗体标记这些颗粒。在室温下用二磷酸腺苷激活20分钟，通过流式细胞术分析PAC-1阳性事件的百分比。