流式细胞术检测人细胞因子诱导的杀伤细胞CD标志物识别

细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）是一类异质性的免疫细胞群体，通过体外（ex vivo）培养外周血单个核细胞（PBMC），并用特定细胞因子和单克隆抗体刺激而获得。CIK细胞包含多种细胞群体，如CD3+CD56+的自然杀伤T细胞（NK-T细胞）、CD3+CD56-的T细胞以及CD3-CD56+的自然杀伤细胞（NK细胞）。

为确定CIK细胞比例，首先准备含有外周血单个核细胞（PBMC）来源的CIK细胞悬液的试管。向指定试管中加入分别与不同荧光染料偶联的抗-CD3和抗-CD56抗体及其混合物。向其他试管中加入与特定抗体所用荧光染料相似的同型对照抗体。

荧光标记的抗-CD3和抗-CD56抗体分别识别并结合CIK细胞群体上表达的CD3和CD56。同型对照抗体不具有靶抗原特异性，可用于检测非特异性背景信号。

用带有细胞筛网帽的圆底管吸取细胞，有助于去除细胞团块。将试管放入流式细胞仪的进样盘中。运行过程中，每个细胞依次通过通道并经过激光束，产生光散射。

一个检测器测量前向散射光强度，反映细胞大小；另一个检测器测量垂直于激光束方向的侧向散射光强度，反映细胞颗粒度。这两项信息共同有助于鉴定免疫细胞群体。

同时，特定激发波长的激光束激发细胞上偶联的荧光染料标记抗体，产生可被检测的荧光信号。

对细胞上特定荧光强度的分析可确定CIK细胞亚群的比例。

按照文本方案中的描述，首先开始CIK细胞的制备。随后，用10毫升无菌PBS洗涤CIK细胞。在300 × g 条件下，于18至20摄氏度离心10分钟。吸除上清液，并用5毫升PBS重悬细胞。使用台盼蓝排斥法对细胞进行计数并检测细胞活力。

将CIK细胞分装至六个无菌的1.5毫升离心管中，每管细胞密度约为每毫升PBS含0.5×10⁶至1×10⁶个细胞。根据文本方案中的说明对细胞进行标记和处理。使用1毫升无菌移液器轻柔吹打至少三次，将CIK细胞与抗体轻轻混匀。将细胞在室温下避光孵育15分钟。

在300 × g 条件下，于18至20摄氏度离心试管10分钟。离心后，吸去上清液，并用1毫升磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀。然后，用1毫升无菌移液器轻柔地将细胞上下吹打至少三次。通过滤帽，轻柔吹打将细胞悬液转移至带有细胞筛滤帽的无菌5毫升聚苯乙烯圆底管中。随后，将试管按顺序放置在样品盘上。

打开流式细胞术分析软件并创建一个实验文件夹。然后，点击“新建样本”按钮，向实验中添加样本和试管。根据文本方案中列出的名称对试管进行命名。

为了对 CIK 细胞群体建立散点图设门系统，首先选择第 1 管，点击点图图按钮，创建 FSC-A/SSC-A 图。在 FSC-A 阈值大于 5,000 的整个细胞群体上绘制矩形门，以排除细胞碎片。

为新的点图选择 FSC-A/FSC-H 参数，并在所有单细胞周围绘制一个多边形门。为新的直方图选择 count 与 FITC-偶联 (CD3) 以及 count 与 APC-偶联 (CD56) 参数。为新的点图选择 FITC-偶联 (CD3) 与 APC-偶联 (CD56) 参数，并绘制一个四象限门以定义四个亚群。

记录每个样本中 20,000 个单细胞的数据。首先点击“加载样本”按钮以分析空白对照样本。利用 CD56 和 CD3 通道参数鉴定完整的 CIK 细胞群体。打开包含各个样本统计值的文件，分析 CIK 细胞群体，并将其重新输出至分析文件中。