小鼠淋巴器官中干扰素-γ分泌的检测方法

干扰素-γ（IFN-γ）是一种由T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）等淋巴细胞分泌的细胞因子，可介导针对病原体的免疫应答。

为了研究原位 IFN-γ 的产生，取一只移植了荧光标记 T 细胞的小鼠，这些 T 细胞经基因工程改造，可表达识别卵清蛋白（一种模型抗原）的受体。

取表达卵清蛋白的基因修饰致病菌悬液，通过静脉注射注入小鼠体内，引发全身性感染。循环中的细菌到达脾脏——一种次级淋巴器官——脾脏通过促进细菌与免疫细胞的相互作用，协助清除病原体。

抗原提呈细胞吞噬细菌并呈递抗原。T细胞与抗原结合 通过 其受体被激活，并产生IFN-γ。

被细菌感染的巨噬细胞会释放免疫介质，并在其表面上调激活配体。当NK细胞与这些信号相互作用时，会被激活并产生IFN-γ。

注入细胞内蛋白质转运抑制剂以限制干扰素-γ（IFN-γ）的分泌，促使其在细胞内积聚。

取出小鼠脾脏。固定组织并进行冷冻，以利于切片。使用冷冻切片机制备薄组织切片，并将其置于载玻片上。加入自然杀伤细胞特异性抗体，该抗体可结合细胞表面标志物，同时加入干扰素-γ（IFN-γ）特异性抗体，用于染色细胞内IFN-γ。这些抗体分别标记有不同的荧光染料。

将载玻片置于荧光显微镜下，检测自然杀伤细胞和T细胞内的干扰素-γ（IFN-γ）。

弃去固定液，加入 5 毫升磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下轻轻振荡孵育 5 分钟。然后更换为 5 毫升 30% 蔗糖溶液，孵育 12 至 24 小时，以维持组织形态。此时，器官会沉入培养皿底部。

为冷冻样品，将干冰放入一个较大的容器中，并在其中放置一个较小的容器，内装约50毫升纯甲醇和几块干冰。用无绒布轻轻擦干脾脏。在底模底部滴加一滴OCT包埋剂，然后将脾脏放入模具中。注意不要产生任何气泡。

在脾脏上加入约 1 毫升 OCT 包埋剂。用镊子将底模放置于干冰浴中甲醇表面，注意确保甲醇不接触 OCT。OCT 冻结后会变稠并呈白色。请务必尽可能快速地冷冻组织，以减少人为假象的产生。

在低温恒冷切片机上，将温度设置为零下21摄氏度。将组织切至约10微米的所需厚度。使用毛笔将切片收集到玻璃载玻片上，并进行肉眼观察。让切片升至室温。

使用液体阻断剂（例如PAP笔）在OCT包埋剂外的组织切片周围画一个圆圈。待组织干燥后，通过在组织切片上滴加100 µL PBS，孵育5分钟以重新水化样本。随后用抽吸法移除PBS，并为每个样本切片加入100 µL封闭液。将切片置于加盖的湿盒中，于室温下孵育至少1小时。

使用一抗染色时，将封闭液替换为各样本预先配制的一抗混合液。在加盖的湿盒中，室温孵育4小时或4摄氏度过夜，随后根据文稿进行洗涤。

现在，将感兴趣的二抗用封闭液稀释至最佳浓度，通常为每毫升2.5微克。移除组织切片上的终末洗涤液，加入配制好的二抗混合液，覆盖切片，在室温下加盖湿盒中孵育1至4小时。

根据文稿要求用洗涤缓冲液洗涤后，移除洗涤液，并用 PBS 进行最后一次洗涤。吸除磷酸盐缓冲液，让残留的 PBS 挥发，但切勿使切片完全干燥。

在载玻片背面用笔画一个圆圈标记组织区域。然后，在样本上滴加一滴封片剂，确保封片剂完全覆盖整个组织切片，再小心地将盖玻片盖在上面。将样本置于避光环境中，室温下静置过夜，使其充分固化。

清晨，将载玻片置于倒置光谱激光扫描显微镜下。调整物镜至10x/NA 0.40，或使用60x/NA 1.4以分析细胞因子的亚细胞定位。