从小鼠全血中纯化和活化血小板

血管损伤后，血小板被募集并活化至损伤部位，形成血小板栓子，启动组织修复过程。

从小鼠全血中纯化血小板并激活 体外取适量密度梯度介质，将血液样本小心地铺加在介质上方，离心以分离血小板与血浆以及红细胞和白细胞层。

将血小板转移至两个含有合适染色缓冲液的新试管中。向其中一个试管加入含有甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸氨基酸序列的合成GPRP四肽，随后加入凝血酶。

凝血酶切割血小板表面凝血酶受体的特定胞外结构域，启动下游信号级联反应并激活血小板。活化的血小板颗粒释放CD62P蛋白，该蛋白迅速转位至细胞膜表面。

GPRP四肽可阻断纤维蛋白原——一种与活化血小板膜跨膜整合素CD41/CD61结合以启动血小板聚集的糖蛋白——从而维持活化血小板处于悬浮状态。

向含有血小板的试管中加入荧光标记的抗-CD41和抗-CD62P抗体。

抗CD41抗体可结合在静息和活化血小板上普遍表达的CD41。然而，抗CD62P抗体仅特异性结合转位至活化血小板膜表面的CD62P。

使用流式细胞术分析细胞。静息状态的血小板表现为CD41+细胞，而活化的血小板则表现为CD41+ CD62P+细胞。

为纯化血小板，使用宽孔径移液器吸头，将 200 微升新鲜采集的全血沿 1.5 毫升离心管管壁缓慢加入，覆盖在 600 微升碘海醇梯度介质上，注意避免混合。

在摆桶转子中离心以分离血小板后，使用新的宽口移液器吸头收集大部分富血小板层，以及少量贫血小板层，注意不要吸到白细胞层或红细胞层。将血小板样品加入新管中，并向血小板中加入 1 毫升 PBS。

在进行另一次离心前，通过倒置混匀血小板。然后，用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于200 µL PBS中。为激活血小板，将1至2×10⁶个血小板转移至含有100 µL染色缓冲液的新管中。另取1至2×10⁶个血小板，加入另一含有100 µL染色缓冲液并补充有0.4 mmol/L GPRP肽的试管中。

向含有 GPRP 肽的试管中加入凝血酶以激活血小板，并向两支试管中加入感兴趣的抗体混合物。作为阳性对照，在含有 0.4 毫摩尔 GPRP 肽的试管中加入最多 100 微升染色缓冲液中的 1 微升全血，并加入凝血酶以激活这些血小板。