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免疫学
0 次观看 • 4:25 分钟 • July 8th, 2025
睾丸中的曲细精管含有支持细胞，这些细胞为生殖细胞提供营养。支持细胞彼此相连 通过 紧密连接，并牢固附着于富含透明质酸的基底膜基质。 这种支持细胞的排列方式可调控免疫细胞进入生精小管，并保护发育中的生殖细胞免于降解。
为了分离支持细胞，从含有部分消化的生精小管的试管开始，这些生精小管来源于小鼠睾丸。这些小管缺乏管周细胞——即环绕生精小管的平滑肌细胞。
用含有透明质酸酶（水解透明质酸所必需）和DNase的酶混合液处理小管。
透明质酸酶进入小管并切割透明质酸——一种基底多糖——从而启动支持细胞从基底膜脱离，并将生殖细胞释放到溶液中。DNase 可消化溶液中的任何 DNA 污染物，防止细胞聚集。
用缓冲液洗涤经酶消化的曲细精管，以去除残留的酶、细胞碎片和生殖细胞。将消化后的曲细精管重悬，并将悬液装入针管组件中。
反复吹打溶液以产生流体动力剪切，破坏支持细胞的紧密连接，从而将其作为单个细胞与残留的生殖细胞一起释放出来。
过滤细胞悬液，去除细胞碎片，获得单细胞悬液。离心滤液以沉淀细胞。
用无血清培养基重悬细胞，以选择性扩增支持细胞。
为了分离支持细胞，使用一支新的25毫升移液管将已沉降的曲细精管在25毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中充分重悬。让曲细精管再沉降12分钟后，用同一支移液管以相同方式洗涤曲细精管三次。随后，将曲细精管转移至一个新的100毫升螺旋盖瓶中，并加入透明质酸酶-脱氧核糖核酸酶I（Hyaluronidase-DNase-I）溶液。接着，在32 °C的摇动水浴中消化曲细精管5分钟。
取少量悬液，在100倍显微镜下进行光学显微镜检查。应可见短小的肾小管、小管聚集体以及释放的细胞。让小管聚集体静置沉降10分钟。然后，使用一支新的25毫升移液管吸除上清液，并用25 ml PBS将聚集体洗涤4次，每次洗涤之间静置沉降10分钟。
污染的PTC细胞群数量将已减少。最后一次洗涤后，向细胞中加入20 ml RPMI 1640培养基，用20毫升注射器连接18号针头，将细胞悬液吹打10次。接着，迅速确认所有细胞团块均已充分解离，再将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤，以获得纯净的单细胞悬液。
使用25毫升移液管离心收集滤液，并小心吸除上清液。然后，将分离得到的塞尔托利细胞重悬于40毫升无血清RPMI 1640培养基中。接着，通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量，并将细胞浓度调整至每毫升3 × 106 个细胞。最后，每孔加入1毫升细胞悬液至6孔板中。