从人外周血单个核细胞中选择性分离 CD4⁺ Vδ1⁺ γδ T 细胞

γδ T细胞表达由具有可变区和恒定区的γ链和δ链组成的T细胞受体（TCR）。

CD4+ Vδ1+ T 细胞——一种 γδ T 细胞亚群——共表达可变的 Vδ1 链和 CD4 共受体。这些细胞迁移至炎症组织，并转分化为功能成熟的 CD4+ 或 CD8+ αβ T 细胞，从而介导免疫应答。

为了从人外周血单个核细胞（PBMCs）中分离出CD4+ Vδ1+ T细胞，需将细胞重悬于缓冲液中。使用Fc阻断试剂封闭细胞表面的Fc受体，以防止抗体的非特异性结合。

加入与荧光素FITC偶联的抗Vδ1抗体，该抗体可结合γδ T细胞上的Vδ1抗原。随后与连接有抗FITC抗体的磁性微珠孵育，磁性微珠将结合到Vδ1 T细胞结合抗体上的FITC染料。

将混合物通过磁性柱，以吸附与磁珠结合的Vδ1+ T细胞；Vδ1- T细胞不结合，随后被冲洗出去。通过加压推动缓冲液穿过磁性柱，强力冲洗以洗脱Vδ1+ T细胞。

将细胞与包被抗-CD4抗体的磁珠共同孵育，磁珠会结合细胞表面的CD4共受体。将试管置于磁铁中，使与磁珠结合的CD4+ Vδ1+ T细胞被吸引；而CD4- Vδ1+ T细胞则保持未结合状态。

将CD4+ Vδ1+ T细胞重悬于培养基中。加入磁珠解离试剂，使磁珠从细胞上释放。将试管重新置于磁铁上，以分离磁珠。

收集 CD4+ Vδ1+ 细胞上清液用于进一步分析。

在开始Vδ1 T细胞分离之前，取1 × 10⁶个PBMC样本，通过流式细胞术检测供体样本中Vδ1CD4阳性T细胞的频率。随后，将剩余的淋巴细胞离心沉淀，并按每1 × 10⁷个细胞加入60微升MACS缓冲液重悬沉淀。

接下来，每 1 × 10⁷ 个细胞加入 20 微升 Fc 封闭试剂进行封闭，随后每 1 × 10⁷ 个细胞加入 10 微升 FITC 标记的抗人 Vδ1 抗体，在 4 摄氏度避光孵育 12 分钟。孵育结束后，用 14 毫升 MACS 缓冲液洗涤细胞。

将沉淀重悬于每 1 x 10⁷ 个细胞 80 微升 MACS 缓冲液中⁷ 细胞，并按每1 × 10⁶个细胞加入20微升抗FITC磁珠⁷ 在4摄氏度避光孵育15分钟后，用10毫升新鲜MACS缓冲液洗涤细胞。

离心过程中，用500 µL MACS缓冲液平衡预冷的磁性柱。然后，将细胞重悬于500 µL MACS缓冲液中，并小心地将细胞悬液加至柱的顶部。

用三份500微升的MACS缓冲液冲洗色谱柱。随后将色谱柱从磁铁上取下，使用推杆迅速将Vδ1阳性细胞用1毫升MACS缓冲液洗脱至15毫升锥形管中。

将细胞通过第二个层析柱后，涡旋混匀25微升CD4磁珠30秒。然后，将磁珠转移至含有1毫升MACS缓冲液的1.5毫升反应管中，并将该管置于磁铁上。

1分钟后，使用200微升移液器小心吸去上清液，并将磁珠重悬于25微升MACS缓冲液中。接着，将分离得到的Vδ1阳性细胞离心，将沉淀重悬于500微升MACS缓冲液中。充分混匀细胞与磁珠。然后，在4摄氏度下持续倾斜孵育20分钟后，将试管重新放回磁铁上。

为避免样品体积损失并尽量减少污染性CD4阴性细胞的存在，必须将残留缓冲液从管盖内侧重新吸回到小瓶中。

两分钟后，使用200微升移液器将含有CD4阴性Vδ1阳性细胞的上清液转移至新管中。然后，将CD4阳性细胞从磁铁上取下，并重悬于500微升MACS缓冲液中。

按照上述方法再去除两次CD4阴性细胞后，将CD4阳性细胞在100微升培养基和10微升磁珠解离液中于室温下孵育45分钟，期间持续轻轻倾斜。孵育结束后，将细胞重新置于磁铁上静置1分钟，然后使用200微升移液器将不含磁珠的、含有Vδ1阳性CD4阳性细胞的上清液转移至新离心管中。

按照上述方法再重复去除残留磁珠两次后，离心收集细胞。随后，将Vδ1阳性CD4阳性细胞重悬于新鲜的预热培养基中，用于计数。