一种体外生成人中性粒细胞胞外诱捕网的技术

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由染色质纤维与抗菌蛋白复合形成的网状结构，可捕获并中和病原体。NETs 由中性粒细胞分泌——中性粒细胞是一种免疫细胞，其细胞质内的特殊颗粒中储存有抗菌蛋白。

研究NET的形成 体外取分离得到的中性粒细胞悬液，加入佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（phorbol myristate acetate，PMA）——一种亲脂性促炎化合物。将细胞接种至培养板，孵育。

PMA 穿过中性粒细胞膜进入胞质，在胞质中结合并激活蛋白激酶 C（PKC）。

活化的PKC会诱导下游信号通路，使NADPH氧化酶（一种酶复合物）的胞质组分发生磷酸化，从而促使该复合物在质膜和颗粒膜上组装。该复合物可产生活性氧（ROS）。

活性氧（ROS）可导致颗粒中蛋白酶和抗菌蛋白的释放。颗粒中的蛋白酶与ROS激活的瓜氨酸化酶共同转位至细胞核。

颗粒蛋白酶导致组蛋白部分降解，而瓜氨酸化酶促进组蛋白瓜氨酸化——中和其正电荷。这些修饰破坏了组蛋白与DNA之间的相互作用，从而引起染色质去凝集。

核纤层的修饰导致核膜破裂和染色质外露；染色质与细胞质中的抗菌蛋白混合，形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。细胞膜的通透化导致NETs释放到细胞外。

弃去上清液，注意不要扰动底部贴附的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）和中性粒细胞。用缓冲液重悬贴附的组分。

离心以沉淀细胞——留下富含NET的上清液，用于后续检测。

为了诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成，向一个150毫米×25毫米的平底组织培养皿中的30毫升中性粒细胞悬液中加入500纳摩尔的PMA，该培养皿内含一个20毫米的网格。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。

孵育后，轻轻吸去并弃去培养基，注意不要破坏附着在培养皿底部的NETs和中性粒细胞层。然后，用移液器加入15 mL不含钙和镁的冷PBS，洗涤每个培养皿的底部，确保将所有附着物从底部彻底清除。

将洗涤液收集至15毫升锥形管中，然后在4摄氏度下以450 × g 离心10分钟。中性粒细胞及任何残留细胞将沉淀至管底，上清液则为无细胞、富含中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的液体。

随后，将上清液分装至多个1.5毫升离心管中，在4摄氏度下以18,000 × g 离心10分钟，使DNA沉淀成团。弃去上清液，将沉淀重悬于PBS中，调整浓度至每100微升PBS中含有2 × 10⁷个中性粒细胞。此无细胞NET储备液可用于后续实验。