小鼠肺组织样本中巨噬细胞胞外诱捕网的表征

巨噬细胞胞外诱捕网（METs）是巨噬细胞释放的一种网状结构，用于捕获并清除病原体。

METs 包含与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和瓜氨酸化组蛋白 H3（H3Cit）相关的细胞外染色质纤维——H3Cit 是一种修饰后的组蛋白，其中的精氨酸被转化为瓜氨酸。

为了表征福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肺组织切片中的微血管栓塞（METs），首先将载玻片干燥。将其浸入二甲苯中以脱去切片中的石蜡。使用含水乙醇对切片进行再水化。

加热切片以破坏甲醛诱导的蛋白质交联，暴露靶抗原，以便后续抗体结合。

加入含蛋白质的溶液以封闭非特异性结合位点。与包含抗MMP-9、抗H3Cit和抗F4/80的一抗混合物共同孵育。

抗F4/80抗体结合巨噬细胞表面糖蛋白F4/80。抗MMP-9和抗H3Cit抗体分别结合METs中的MMP-9和H3Cit。加入不同荧光染料标记的二抗，使其结合各自已与靶标结合的一抗。

使用含 DAPI 的封片剂封片。DAPI 可染色 METs 的染色质纤维。利用共聚焦显微镜对切片进行成像，以观察 MET 标记物的荧光。

METs 的特征是其细胞外染色质纤维以及 F4/80、MMP-9 和 H3Cit 的共表达。

为对FFPE样本进行抗原修复预处理，先将切片在60摄氏度的烘箱中干燥60分钟。随后，将切片转移至二甲苯溶液中处理30分钟，再将样本转移至室温下的70%乙醇中处理5分钟。

用自来水冲洗载玻片后，将其放入耐热塑料膜中，并置于压力锅内的 Tris-EDTA（pH 9.0）中加热10分钟，以进行更强的抗原修复。样本冷却20分钟后，转移至自来水。然后在摇床上用自来水洗涤5分钟。重复一次自来水冲洗，随后在摇床上用PBS冲洗一次。

为封闭样本，将10%的鸡血清加入5% BSA/PBS中，室温孵育30分钟。随后，为鉴定巨噬细胞外陷阱（即巨噬细胞中的METs），将一抗以1:100的比例稀释于1% BSA/PBS中，加入后于4摄氏度孵育载玻片16小时。

使用 PBS 在摇床上孵育 5 分钟，洗涤样本两次。加入含 1% BSA/PBS 的相应荧光二抗，在室温下孵育载玻片 40 分钟。用 PBS 洗涤后，使用含 DAPI 的封片液对染色质进行染色并封片。

使用倒置显微镜连接的共聚焦激光扫描头，采用20倍0.1数值孔径（NA）的平场消色差物镜和40倍1.0数值孔径（NA）的油镜采集荧光图像。通过点击逐线扫描及平衡按钮，获取512×512像素的单层图像。每个样本区域至少采集10个视野用于分析，并为每项结果提供相应数据。