Name: 发育研究的窗口鸡蛋 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 学习鸡胚蛋制备技术用于神经生物学研究，优化胚胎存活时间以支持细胞命运图谱绘制。该方法包括清洁、开窗、抽取蛋白液等步骤，便于进行微珠植入、染料注射等操作。

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1. 从培养箱中取出卵
<ol>
<li>在相对湿度高于60%的条件下，保持37°C培养。</li>
<li>取出鸡蛋；将鸡蛋旋转90°，使较大的底部呈水平放置。</li>
</ol>
2. 擦拭鸡蛋以灭菌
<ol>
<li>用70%乙醇浸透一叠非无菌纱布。</li>
<li>使用两到三片纱布擦拭最多5个卵。纱布污染后即弃用。</li>
</ol>
3. 准备去除蛋白的位点
<ol>
<li>剪取一片 1 英寸 × 1 英寸的 3M 塑料胶带，置于基座左侧，以保护白蛋白被抽出的区域。</li>
</ol>
4. 去除蛋白
<ol>
<li>用剪刀尖在胶带中央刺一个小孔。</li>
<li>使用带有18号、1英寸针头的10 cc注射器，缓慢将针头穿过剪刀所刺的小孔。</li>
<li>以45°C角度将针头向下刺向蛋的底部。</li>
<li>将针头向中心倾斜，抽取3至4 mL的蛋清。</li>
</ol>
5. 窗宽调节
<ol>
<li>裁剪一块 3 英寸 × 3 英寸的塑料胶带，将其拉伸后覆盖在鸡蛋顶部。将正方形胶带的四个角沿鸡蛋水平面的弧形末端延展，注意不要过度拉扯。使胶带紧贴鸡蛋表面，确保无褶皱。</li>
<li>使用一把锋利的 4 英寸直头解剖剪，在胶带覆盖区域底部中心处扭转出一个孔。缓慢将剪刀的下刃插入鸡蛋，确保剪刀尖端始终紧贴蛋壳内壁。将刀刃朝向底部方向，缓慢开始切割蛋壳。按逆时针方向进行，至接近顶部中心时停止。取出剪刀，反向重复操作，直至仅剩少量蛋壳相连。检查确认鸡蛋已受精。关闭窗口。</li>
</ol>
6. 封闭、重新打开并密封卵壳。
<ol>
<li>取一段长约5-8厘米、宽约1.3厘米的塑料胶带，将其贴回原先切开的孔洞处，确保封口严密。另取一块1×1英寸的胶带，封住用于抽取蛋液的孔洞。使用镊子重新打开蛋壳以进行所需操作。当准备将蛋放回孵育箱时，剪下一块足够大的胶带，将其完全覆盖在窗口处，并密封整个蛋的水平表面。</li>
</ol>

<ol><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).</li>
<li>Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).</li>
<li>Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).</li>
<li>Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).</li>
</ol>

该方法可在实验操作后实现较长的胚胎存活时间。例如，染料标记研究中，胚胎可在命运图谱研究中存活至E10或更晚阶段（1）。此外，该技术已用于鸡胚内电穿孔研究，通过调节基因表达水平，并使胚胎发育持续至后续发育阶段（2-6）。这种开窗技术可与任何需要胚胎操作后继续存活的实验程序联合使用。

<table><tbody><tr><td>旋转培养箱</td><td> </td><td>Profi</td><td></td><td>维持在 37&amp;deg; 摄氏度，相对湿度保持在 60% 以上</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>纱布</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>3M 塑料胶带</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>10 毫升注射器</td><td> </td><td></td><td></td><td>每枚鸡蛋使用 1 个</td></tr><tr><td>18G 针头</td><td> </td><td></td><td></td><td>1&amp;#189; 英寸针头，每支注射器配 1 个</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td> </td><td></td><td></td><td>4&quot; 锋利直刃</td></tr><tr><td>受精卵</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

用于发育研究的鸡胚开窗法

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

发育研究得益于鸡胚作为实验模型的广泛应用。鸡胚易于接触的特性使得研究人员能够采用多种方法标记细胞命运，包括鸡-鹌鹑嵌合体和局灶性染料标记技术。此外，该模型还适用于多种分子干预手段，如蛋白包被珠的植入以及通过胚内电穿孔导入质粒DNA。这些实验为中枢和外周神经系统的发育研究提供了重要数据。在许多此类研究中，必须打开蛋壳并在不干扰胚胎发育的情况下重新封闭。通过再次打开蛋壳，可对胚胎在连续发育阶段进行观察。尽管已有多种优秀的鸡胚蛋壳打开方法，本文介绍的是一种经过优化、可实现较长存活时间的方法。该方法中，将鸡蛋侧放，在蛋壳上切开一个小窗口。实验操作完成后，将原蛋壳复位并覆盖蛋窗，在其上覆盖透明塑料胶带，以保护胚胎并帮助维持孵化剩余期间的湿度。该方法自孵化两天起开始使用，已成功实现胚胎至成熟阶段的存活。

胚胎易于获取的特点使得研究人员能够采用多种方法进行细胞命运图谱的绘制实验，包括鸡-鹌鹑嵌合体和局灶性染料标记等技术。本文中，我们展示了一种已优化用于延长存活时间的卵子制备方法。

发育研究因采用鸡胚作为实验模型而得到极大推动。鸡胚易于接近，……

欢迎来到Kramer实验室。我是加州大学欧文分校神经生物学与行为学系的Matt Korn。今天我将向您展示如何准备鸡胚蛋以进行多种操作，包括放置琼脂糖珠、注射染料或进行鸡胚内探查。那么，事不宜迟，让我们开始吧。首先，我们要着手清理鸡蛋，原因是孵化箱中可能存在多种污染物。我们将用胶带将其密封。我们不希望有任何细小的碎屑进入窗口区域，以免在取出胚胎时增加胚胎死亡的风险。因此，如您从培养箱中所见，卵应将较大的一端朝上放置。我们将把鸡蛋侧放。这样做有两个目的：第一，我们的操作窗口就位于此处；第二，胚胎需要上浮到顶部，以便我们进行各种操作。我将从培养箱中的架子上取出几枚鸡蛋，放入一个纸板制的蛋托中。这个蛋托实际上是鸡蛋递送时包装箱内附带的部分。因此，今天我们直接用它来盛放鸡蛋。现在如何摆放就由你决定了。我喜欢这样放置，因为这样我可以随时接触到所有的卵，并且它们彼此之间互不接触。万一我发现其中有一颗卵有裂缝而脱落，它们之间也都有一定的空间，不会相互影响。现在，我将取用这里的纱布，取出这样整齐的一叠，然后将其分成两半。接着，我会取70%酒精，慢慢倒入，直到感觉底部开始变潮湿为止。这是因为我要用整叠纱布来擦拭所有的卵。然后我只需取走顶部的少量酒精，继续操作，实际上几乎要覆盖整个卵的表面。酒精干燥得很快，之后我们就可以继续在卵上贴胶带。胶带会很好地粘附，等到我完成一组操作时，通常第一个卵已经干燥，我们便可以继续进行卵制备的下一步骤。再次，将棉签放回垃圾桶中，接下来我们就可以进行下一步了。好的，现在所有鸡蛋都已用酒精擦拭完毕，我们可以继续在鸡蛋较大的一端，也就是鸡蛋的底部，打一个排水孔。这样我们就能进入蛋内并抽出部分蛋清，因为如果不抽出蛋清，胚胎就无法正常固定位置。我们无法进行任何操作。因此，这只需要我取一把刀片和这条塑料胶带即可。这种胶带有一点弹性，非常合适。它不仅能在孔洞比我们预期稍大时进行扩展，而且在实际覆盖整个卵时，我们还需要对其进行拉伸。因此，窗口所在区域必须完全覆盖。现在我将直接这样切下这块膜，然后制作一条大约一毫米宽的细条。然后，我可以从这上面裁下一小块约一平方毫米的胶带。接着，我将直接把它贴在日期左上方的位置，就放在那里，你可以看到。它粘得非常好。然后我可以回到之前制作的条带上，再剪下一段一毫米长的胶带。接着，将其放置在数字左侧的位置，也就是卵的顶部。现在我们已经将它侧放，它位于右侧。这里再放一个部件。目前我没有戴手套，因为戴手套会使胶带粘在手套上，而且我已经洗过手了。目前我并不太担心其他任何物质会污染活性成分。因此，我将直接使用一把尖头剪刀，从我贴胶带位置的中心插入，然后顺时针旋转，直到将其稍微切开一点。你会看到那里有一个小孔。这个孔不需要很大，因为一旦我们将注射器插入，孔就会被撑大到足够尺寸。这样做是为了避免直接用针头刺入，以免试图击破蛋壳时经常导致蛋壳一侧完全破裂。然后我们就不能再使用这个蛋了。好的，现在我将开始排出蛋液。我们在蛋壳侧面已经打了一个不错的小孔，接下来我会使用这个10毫升的注射器和一根较粗的针头，将蛋清抽出来。现在我需要大约三到四毫升，一定要超过三毫升，但不要远超过四点五或五毫升。这样可使目前位于顶部的胚胎稍微远离外壳，便于我们进行后续操作。因此，以45度角插入，我就能到达蛋黄下方。然后我只需将针头稍微向右转动，以便悄悄滑入下方，此时可以感觉到针尖轻轻触碰到蛋壳底部。接下来，我将抽取大约三到四微升，液体能很顺利地被抽出。现在我要把白蛋白放入我的腰桶中，然后就可以继续处理其他鸡蛋了。好的，接下来我将继续操作。你们会看到，我为引流所打的孔比预想的稍大一些，但结果证明这并没有问题。我需要关注的是，在插入针头时不要再把蛋壳弄裂了。因此，我将小心地进行这一步操作。好的，目前我已经看到蛋壳上出现了一道细小的裂纹。现在的小裂纹是可以接受的，但当裂纹延伸到蛋的另一个平面时，您就需要关注了。而在此情况下，裂纹确实已经延伸。您可以通过这个孔洞看出来。它几乎延伸到了顶部。事实上，我们的窗口将位于此处。因此，对于这个卵来说很遗憾，我们将不得不将其移除并丢弃。丢弃它并没有什么特别的注意事项。你不需要撰写特定的处理流程或任何其他说明。只需将其放入废物桶即可。我们使用这些黑色垃圾桶来专门存放动物废弃物，除此之外，其他事项都已处理完毕。接下来我们可以进行下一个鸡蛋的操作。好的，现在我们已经将所有鸡蛋的液体倒出，可以继续进行下一步，即封堵排水孔。这一点非常重要，因为如果不这样做，在培养箱内残留的白蛋白会大量蒸发。而干燥的卵意味着死亡的卵。因此，我们将继续使用大约相同大小的胶带覆盖住这个孔，这样就无需再次打开这个孔了。在某些情况下，如果你决定在打开鸡蛋后尝试从中提取更多的蛋清，此时这个小孔可起到一定的密封作用，你可以将针头插入其中，而不会损失太多蛋清。好的，是这样吗？好的，现在我们将继续用一块大小合适的胶带将鸡蛋覆盖住。我将这个过程类比为在气球上贴一小块胶带，然后再用针轻轻刺入。有趣的是，气球不会爆裂；同样地，在鸡蛋上贴一小块胶带，鸡蛋也不会在多个位置开裂。随后可以将窗口密封，当窗口关闭时，由于使用了胶带，能够形成一个良好的密封效果，我们也就无需担心任何蒸发问题。因此你可以看到胶带的尺寸，这可能是我目前裁剪过的最大的一块，但即便如此，我还是会再稍微拉伸一下，轻轻拉拽，施加一点张力，然后将其覆盖在鸡蛋上。接下来，我会从后侧绕过去，非常小心地将胶带拉伸覆盖整个鸡蛋，确保我即将开窗的位置没有褶皱。你可以稍微调整一下胶带的位置。它不会粘得很厉害，所以不必担心。一旦粘住了，就固定了。你可以看到，我将要着手切割窗口的区域就是这里。现在所有鸡蛋上都贴好胶带了，我们可以继续在顶部切一个窗口。这一步可能是最困难的部分，通常也是大多数鸡蛋容易损失的环节。因此，我先用沾有酒精的纱布仔细擦拭一下剪刀，然后再将其擦干。酒精基本上会自行挥发干净，但你不希望酒精直接进入卵内。因此，我会将刀片插入胶带覆盖区域的正中央，并再次使用顺时针和逆时针交替的运动，直到我听到轻微的开裂声。这时我就知道刀片已经进去了。然后我想将剪刀稍微向外移动，使其几乎平贴在蛋壳表面。接着只需进行微小的剪切，直到能将整个剪刀尖端插入其中。当我剪出大约半个圆时，再从另一侧返回操作，但不要完全剪成一个闭合的圆，因为我想留下一个窗口，这样就可以直接将蛋壳打开。目前看来，它们的发育阶段基本符合我的预期，血管分布还不多，但在胚胎所在位置周围已出现少量血液，主要来自卵黄区域，血液已经开始循环，但心跳已经停止。因此，我将关闭培养装置，让样本保持这样的状态静置，然后再次绕回，继续关闭窗口。同样，将其轻轻压平贴合表面，再反向操作一次。好的，这里有几个气泡，结果发现胚胎偏向一侧。现在我们有两种处理方式。如果我们有足够的卵子，并且不介意使用每一个卵子，那么我们可以直接丢弃这个。或者，我们可以关闭窗口，仅进行设置，使胚胎重新漂浮到顶部我们所需的位置。等到我们进行操作时，胚胎可能已经到达理想位置。如果仍未到位，我们可以在当时将其弃用。我在这里所做的就是将其倾斜一定角度。这样会有一点白蛋白流出，但有助于胚胎回到其应处的位置。好了，现在我们已经打开了所有这些窗口，需要确保它们都已关闭，在进行任何操作之前，必须先将其封闭。然后我们可以继续将蛋重新封好。但如果有一个开口，蛋黄有时会滑出。当你从一个房间走到另一个房间时，如果蛋稍微倾斜一下，你肯定不希望里面的东西全部掉出来。因此，我只是在塑料胶带上裁下一小段，宽约1毫米，长度大约2到3毫米。我喜欢将它贴在正中间。如果我能把它拉到卵的前方，就能使其绷紧。你可以看到窗口的位置，正好是之前贴胶带的地方，也就是我们切割窗口的位置，这样暂时已经相当密封了。我的意思是，我们马上就要进行一些操作，所以暂时不需要完全气密。这就是制备和开窗处理鸡蛋的方法。祝您的实验顺利。

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发育研究的窗口鸡蛋

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