活体成像观察γδ上皮内淋巴细胞

γδ 上皮内淋巴细胞（γδ IELs）是一类表达 γδ T 细胞受体的特殊迁移性 T 细胞。这些细胞主要存在于肠上皮内，通过在上皮内巡逻来限制病原体穿越肠道。

为了在活体生物中观察 γδ 上皮内淋巴细胞（γδ IELs），首先准备一只已麻醉的转基因小鼠，其小肠部分暴露。该转基因小鼠经过基因改造，可特异性地在 γδ IELs 中表达报告蛋白——增强型绿色荧光蛋白，从而实现对这些细胞的追踪。

使用电灼器在暴露的小肠对系膜缘表面创建一条穿孔线，以防止过度出血。

沿穿孔线做纵行切口以暴露肠黏膜，可见多个指状突起——绒毛。每根绒毛均含有上皮细胞，其内驻留的γδ上皮内淋巴细胞（IELs）突入肠腔内。

将小鼠带有暴露黏膜面的一端直接接触荧光染料，使管腔呈现红色荧光。

在共聚焦显微镜下对小鼠进行成像。定位一个绒毛，并从绒毛顶端上皮开始，沿 z 轴在不同焦平面上进行成像。将这些光学切片合并，生成三维图像。

活体成像显示绿色荧光标记的γδ上皮内淋巴细胞沿红色管腔附近的上皮细胞基底膜动态移动。

在血管下方的肠系膜两侧各放置一对镊子，轻轻摩擦镊尖，在膜上形成一个小孔。使用弯头镊子和连接在5厘米缝线上的弯曲锥形针，从膜的小孔处穿透一侧腹膜，再向上穿过另一侧腹膜内壁，在切口顶部和底部附近各缝一针，以关闭切口，同时保持肠段外置。

为了提高成功率，在放置腹腔结构时，不要结扎或撕裂任何血管，并尽量减少对肠管的额外操作。

然后，以相同方式缝合肠袢下方的皮肤，在先前腹膜缝线之间的切口中部放置一针缝线。使用电灼器沿对系膜缘进行穿孔，随后立即在肠表面滴加数滴水，以防止热损伤导致的额外组织损伤。

用Kimwipe擦拭以去除残留水分。使用Vannas剪刀在灼烧组织远端边缘沿灼烧线向体外组织段近端方向剪一个约1.5厘米长的水平切口。当黏膜面暴露后，用湿润的Kimwipe覆盖腹部，以保持组织湿润。

进行转盘共聚焦显微镜成像时，将小鼠置于带盖容器中运送至显微镜。启动成像软件，向后倾斜显微镜头部，并在玻璃盖玻片底部加入150微升含1微摩尔fleet AlexaFluor染料的Hank's平衡盐溶液。调整小鼠位置，使打开的黏膜表面直接接触盖玻片。

将小鼠和培养皿放置于预热的培养箱内的成像台上。设置每条激光的激发强度不超过10至15毫瓦，曝光时间不超过120至150毫秒，并将帧平均值调整为“2”。

开启电子倍增增益功能以降低背景噪声，并选择63倍物镜校准，以确保像素尺寸的准确测量。使用405纳米激光和20倍空气物镜，手动观察细胞核，定位无明显运动或漂移的绒毛区域，避开因呼吸、蠕动或心跳引起的伪影运动区域。

使用 XY 扫描记录目标区域的 x-y 坐标，然后切换至甘油浸没式 63X 物镜。在 405 纳米通道上获取实时图像，持续时间最长为 1 分钟，以确认所选区域中的绒毛保持稳定，同时调节焦距以找到绒毛顶端正下方的正交平面。

然后，从绒毛顶端上皮下方约15至20微米处开始采集Z轴序列图像，向下至绒毛，直至使用1.5微米步长难以分辨细胞核为止。开始采集后3至5分钟，确认图像稳定性以及γδ型上皮内淋巴细胞的运动情况，并继续对每一片段绒毛采集图像30至60分钟。