基于纳米颗粒的抗原特异性CD8+ T细胞富集与扩增

将小鼠脾脏和淋巴结在细胞筛上进行研磨。用适当的缓冲液冲洗细胞筛，以收集脾细胞和淋巴细胞。

将细胞与生物素标记的抗体混合物以及磁性抗生物素微珠共同孵育，这些微珠可结合非CD8+细胞。

将细胞悬液通过磁性柱。由于磁力作用，与磁珠结合的非CD8+细胞会结合在柱壁上，而CD8+ T细胞则被洗脱出来。

将洗脱的细胞与人工抗原呈递细胞（aAPCs）共同孵育。这些人工抗原呈递细胞是磁性纳米颗粒，其表面修饰有负载抗原的主要组织相容性复合物-免疫球蛋白融合蛋白（MHC-Ig）和抗CD28抗体。

抗原负载的MHC-Ig与抗原特异性的CD8+ T细胞上不同的受体结合。抗CD28抗体与T细胞上的CD28受体相互作用，启动T细胞活化。

将含有磁性纳米颗粒和细胞混合物的试管置于磁力架上。与aAPC结合的CD8+ T细胞会被磁场吸引，而非特异性CD8+ T细胞则保持悬浮状态。移除上清液。

从磁力架上取下离心管。用含有T细胞生长因子的培养基重悬与aAPC结合的细胞。将细胞接种至多孔板中。

生长因子诱导抗原特异性的 CD8+ T 细胞扩增。 

为分离抗原特异性的CD8阳性T细胞，将野生型C57Black/6j小鼠的脾脏和淋巴结通过无菌的70微米细胞筛网研磨，并用PBS频繁冲洗，然后根据试剂盒说明书使用非接触式CD8阳性T细胞分离试剂盒去除非CD8阳性T细胞。

计数后，通过离心收集分离的CD8阳性T细胞，并将沉淀重悬于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，PBS中添加0.5%牛血清白蛋白和2 mmol/L EDTA。

然后，将细胞与纳米颗粒人工抗原呈递细胞共同孵育，使每细胞对应的纳米颗粒人工抗原呈递细胞数量为 1 x 10¹¹ 肽负载的MHC-Ig，每1×10⁶ 在4摄氏度下，将分离的CD8阳性T细胞置于无菌的5毫升聚苯乙烯圆底管中，持续混匀孵育1小时。

孵育结束后，按照所示方法在磁力架上将纳米颗粒细胞悬液洗涤三次，最后一次洗涤后，用500微升含1% T细胞生长因子的新鲜补充培养基重悬人工抗原呈递细胞和富集的CD8阳性T细胞。

为了获得最大细胞回收率，必须将细胞中的磁珠在磁力柱上保留至少2分钟，并小心吸取缓冲液，避免扰动处于磁场中的磁珠和细胞。

计数后，将2.5 × 10⁵个富集的CD8阳性T细胞与磁性颗粒混合物加入含1% T细胞生长因子（TCGF）的160微升完全培养基中，接种于96孔U型底培养板中。第3天时，每孔加入含2% T细胞生长因子的80微升完全培养基进行换液，然后将培养板放回细胞培养箱中继续培养4天。

第7天，将刺激后的细胞收集至5毫升圆底管中进行计数，并通过离心收集细胞。用0.5毫升含0.05%叠氮化钠和2%胎牛血清的PBS重悬细胞沉淀用于计数，并将5 × 10⁴ 至 5 × 10⁵ 个细胞分装至新的5毫升圆底管中，用于抗原特异性染色。

将适当的试管标记后，加入生物素化的MHC-Ig和抗小鼠CD8a抗体，在4摄氏度孵育1小时，随后用新鲜的PBS进行离心洗涤，以去除未结合的生物素化免疫球蛋白。然后，在4摄氏度条件下，使用适当的链霉亲和素偶联的二抗以及适当的活/死可固定死细胞染料对样本染色15分钟，按照标准操作流程在流式细胞仪上检测细胞，以确定抗原特异性的CD8阳性T细胞的特异性和数量。