一种体外诱导初始T细胞分化为产生GM-CSF的辅助性T细胞的技术

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）由产生GM-CSF的辅助性T细胞或T_HGM细胞分泌。这些细胞对其他辅助性T细胞特异性细胞因子的表达水平较低。

开始 体外 T细胞分化_HGM细胞，取含有抗原激活的成熟细胞和未分化的初始细胞的辅助性T细胞悬液——该悬液分离自小鼠脾脏。

加入针对初始细胞和成熟细胞特征性表面标志物的荧光标记抗体。通过荧光激活细胞分选技术分离初始T细胞。

将细胞接种至已包被有可结合T细胞受体复合物的抗体的孔板中。加入可结合共刺激受体的抗体。通过协同结合激活细胞。

加入白细胞介素7（一种细胞因子），以诱导分化为T_HGM细胞并促进粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的产生。同时加入佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA，一种促炎性化合物）、离子霉素（一种钙离子载体）以及一种蛋白质转运抑制剂。

PMA进入细胞并激活一种蛋白激酶。具有膜通透性的离子霉素将钙离子转运至细胞内，从而提高细胞内钙离子浓度。

蛋白激酶的活化和高钙水平启动信号，重新刺激T_HGM细胞，从而导致粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的产生增加。蛋白转运抑制剂可阻断GM-CSF的分泌，有助于其在细胞内的检测。

进行免疫荧光染色以检测细胞内细胞因子，并通过流式细胞术分析细胞。若大多数细胞呈现高水平的GM-CSF但其他细胞因子表达较低，则表明T_HGM细胞分化成功。

为了分离 CD4 阳性 T 细胞，将白细胞沉淀重悬于 5 毫升细胞分离缓冲液中，并通过 30 微米滤网过滤细胞悬液至新的 15 毫升离心管中，以去除任何碎片。计数后，将细胞重悬于缓冲液中，浓度为每 90 微升缓冲液含 1 × 10⁷ 个细胞，每 1 × 10⁷ 个细胞加入 10 微升抗 CD4 偶联磁珠，在 4 摄氏度孵育 15 分钟，每 5 分钟混匀一次。

在细胞孵育的同时，将分离柱置于磁力架上，并用 2 毫升缓冲液预润洗柱子。随后，用 5 毫升缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于 1 毫升缓冲液中。将样品加载到柱子上，收集 CD4 阴性组分至 15 毫升锥形管中。

当所有细胞均通过层析柱后，在储液槽干燥前，每次用1毫升缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，将层析柱转移至新的15毫升锥形管中，加入2毫升细胞分离缓冲液冲洗层析柱，以洗脱阳性磁珠组分。随后，通过离心收集CD4阳性细胞。

对于初始T细胞的荧光激活细胞分选，将磁珠分选得到的CD4阳性细胞沉淀重悬于500微升缓冲液中，并加入适量的荧光标记抗体混合物与细胞混合。冰上避光孵育20至30分钟后，用5毫升新鲜缓冲液洗涤细胞，再将细胞沉淀重悬于500微升新鲜缓冲液中。

将细胞通过尼龙滤网过滤，然后转移至预装有500微升缓冲液的FACS管中。设门以选择CD4阳性、CD25阴性以及CD44低表达、CD62配体高表达的细胞群体。随后，将初始CD4阳性、CD25阴性、CD44低表达、CD62配体高表达的T细胞组分分选至新的15毫升离心管中，并通过离心沉淀分离得到的初始CD4阳性T细胞。

对于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和辅助性T细胞分化实验，将分选后的T细胞以每毫升1 × 10⁶个细胞的浓度重悬于含有50微摩尔β-巯基乙醇的完全RPMI培养基中，并从预编码的48孔板的每孔中吸出抗CD3ε抗体。

然后，将 2.5 × 10⁵ 个细胞接种至每孔中，同时加入 IL-7、抗 CD28 和抗 IFN γ，于 37 摄氏度、5% CO₂ 条件下培养三天。培养第三天，使用显微镜观察细胞分化情况，并收集细胞进行离心。

将沉淀重悬于新鲜的完全RPMI培养基中进行两次洗涤，第二次洗涤后用1毫升新鲜完全培养基重悬细胞，用于计数。将细胞均分为三等份，其中第一份加入PMA和离子霉素，并在蛋白转运抑制剂存在下刺激4至6小时。

刺激结束后，收集细胞并用抗CD4抗体进行染色。30分钟后，加入200微升固定缓冲液固定细胞20至60分钟，随后每次用1毫升破膜缓冲液洗涤两次。然后，在避光条件下染色30分钟，以检测细胞内细胞因子的表达。