鉴定可调节胸腺细胞对强TCR信号反应的激酶抑制剂

将小鼠胸腺细胞置于多孔板中。加入包被有抗CD3和抗CD28抗体的磁珠。向部分孔中加入适当浓度的待测激酶抑制剂。孵育。

抗体与双阳性胸腺细胞表面的 CD3 和 CD28 受体结合并激活这些细胞，导致 T 细胞受体（TCRs）下调以及胞质蛋白激酶的激活。

这些蛋白激酶激活下游信号通路，导致细胞表面CD69表达增加以及胞质中caspase-3活化。活化的caspase-3切割细胞内关键蛋白，从而启动胸腺细胞凋亡。

在用激酶抑制剂处理的细胞中，这些抑制剂会阻断胞质激酶，从而调控 CD69 表达和半胱天冬酶-3 的活化。

加入含有荧光标记抗体的混合液，该混合液可结合胸腺细胞的 TCR、CD4 和 CD8 共受体以及 CD69 受体。用缓冲液处理胸腺细胞，使其固定并通透化。

使用荧光标记的抗caspase-3抗体孵育，该抗体可结合胞质中的caspase-3。通过流式细胞术分析胸腺细胞。

对照组双阳性胸腺细胞表达荧光细胞表面标志物 CD4、CD8 和 CD69，以及胞内 caspase-3，并显示 TCR 下调。相比之下，经抑制剂处理的胸腺细胞表现出较低水平的荧光 CD69 和 caspase-3。

开始用激酶抑制剂处理胸腺细胞时，使用多通道移液器将40 µL胸腺细胞加入小体积培养板的每个孔中。将培养板置于冰上。然后，将一份激酶抑制剂、DMSO和地塞米松，以及四份完全RPMI培养基加入96孔板中。

在小体积培养板中指定八个孔作为未处理对照组，四个孔加入稀释后的地塞米松（终浓度为5微摩尔）作为细胞死亡的阳性对照组，另四个孔加入0.5微升稀释的DMSO作为溶剂对照组。随后，从抑制剂板的相应孔中，向96孔板中每孔加入0.5微升稀释后的各抑制剂。

开始胸腺细胞刺激时，首先确保抗CD3和CD28磁珠均匀重悬。接着，用2毫升PBS缓冲液洗涤1毫升磁珠。将试管置于磁力架上，使磁珠与上清液分离，并吸除溶液。然后，将磁珠重悬于1毫升完全RPMI培养基中。

向每个经抑制剂处理的样本、四个经DMSO处理的样本以及八个未经处理样本中的四个，每孔加入10微升磁珠悬液；向剩余的四个未经处理的孔中每孔加入10微升完全RPMI培养基。

使用微量培养板轨道摇床轻轻振荡培养板。随后，将胸腺细胞在37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育17至20小时或过夜。

首先，使用150毫升乙醇-Tween溶液对自动化层流洗板机进行预处理，然后使用添加了1% Tween-20的去离子水冲洗，最后使用FACS洗涤缓冲液冲洗。孵育结束后，利用洗板机系统以FACS洗涤缓冲液对酶标板进行9次洗涤循环。每次洗涤通过层流方式加入并移除55微升洗涤缓冲液，从而实现对孔中试剂的指数级稀释。

为了染色表面抗原，首先将一单位体积的抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8和抗-CD69抗体稀释于100单位体积的FACS洗涤缓冲液中。然后，将细胞重悬于25 µL染色抗体混合物中。使用微量平板振荡器轻轻振荡平板，随后将平板置于冰上孵育30分钟。

固定细胞时，首先使用55微升FACS洗涤缓冲液，按照之前所述的九次洗涤循环清洗培养板。然后，向每孔中加入50微升固定和破膜缓冲液。充分混匀后，将培养板置于冰上孵育30分钟。孵育结束后，通过将提供的10倍浓缩液25毫升加入225毫升超纯水中，配制1倍破膜/洗涤缓冲液。

使用1×缓冲液预洗洗板机，然后按照之前所述的九次洗涤循环，每孔加入55微升1×缓冲液洗涤平板。取1毫升抗caspase-3抗体与2毫升1×透化洗涤缓冲液混合。每孔加入25微升该混合液至固定后的细胞中。

使用微量培养板轨道摇床轻轻振荡平板。将平板置于冰上孵育1小时。孵育结束后，用1×破膜洗涤缓冲液重复洗涤步骤，共洗涤九次。然后，向平板的所有孔中加入25 µL FACS洗涤缓冲液，用移液器吹打数次以混匀溶液。

最后，将混合后的样品转移至微量离心管中，用FACS洗涤缓冲液补足至总体积200微升，随后进行流式细胞术分析。