小鼠骨髓来源巨噬细胞对抗体刺激的活化

病原体暴露后，巨噬细胞会发生活化，并释放促炎性和抗炎性细胞因子，协调免疫系统的应答。

研究骨髓来源巨噬细胞的活化 体外将分离的小鼠骨髓细胞悬液转移至培养瓶中，短暂孵育。

间充质细胞、单核细胞和成熟巨噬细胞会贴附在培养瓶表面，而造血祖细胞则保持悬浮状态。

收集含有造血祖细胞的培养基并进行离心。将重悬于巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）培养基中的细胞转移至培养瓶中。

M-CSF 可诱导髓系祖细胞亚群分化为巨噬细胞，这些巨噬细胞呈分支状并贴附于培养瓶。

弃去含有非贴壁细胞的培养基，加入M-CSF培养基并孵育。当巨噬细胞达到完全功能状态后，收集细胞，离心。

将巨噬细胞重悬于含M-CSF的培养基中，并接种至多孔板的孔内。待巨噬细胞贴壁后，加入人多克隆免疫球蛋白和细菌脂多糖（LPS，一种毒素）。

免疫球蛋白与特定的 FCγ 受体结合，而脂多糖（LPS）则与巨噬细胞上的 Toll 样受体结合。这种共刺激可促进抗炎性巨噬细胞的活化 通过 下游信号级联反应，导致高水平的抗炎细胞因子和低水平的促炎细胞因子释放。

收集含有细胞因子的培养基，用于进一步分析，以确认巨噬细胞的活化。

将已处死的小鼠仰卧位固定于泡沫板上，四肢伸展，然后用70%乙醇清洁腿部。接着，进行约2毫米深的浅层切口，去除后肢表面的皮肤和毛发。随后，解剖组织以暴露胫骨和股骨。

为取出胫骨和股骨，需在髋关节下方和踝关节上方切断骨骼及肌肉组织。随后，尽可能去除附着在骨骼上的肌肉组织。接着，用70%乙醇清洗骨骼，并静置使其挥发1分钟，然后将骨骼放入装有骨髓冲洗培养基的6孔板中。

在培养皿中，从股骨两端各修剪掉1毫米，以暴露其内部腔隙。确保26号针头能够进入腔隙。接着，将胫骨与股骨从膝关节处分离。然后，将连接10毫升注射器的针头插入骨腔，收集骨髓。

将4根骨骼中的骨髓汇集到一个50毫升的锥形管中，加入5毫升骨髓冲洗液。用移液器反复吹打数次，或以低速涡旋震荡，轻轻分散悬液中的团块。骨髓条状物应被分散成小于半毫米长的小碎片。

接下来，用骨冲洗培养基将离心管补至 50 毫升，并转移至 75 平方厘米的组织培养瓶中。将骨髓孵育 1 小时。在孵育过程中，成熟细胞会贴附于培养瓶壁，而目标造血祖细胞则保持悬浮状态。将悬浮液转移至 50 毫升锥形离心管中，离心使细胞沉淀成团。

接下来，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 毫升 MCSF 培养基中。然后调整细胞密度至每毫升 500,000 个，并将 30 毫升细胞悬液接种至一个新的 75 平方厘米培养瓶中。继续培养细胞，并在第 4、7 和 10 天使用倒置相差明场显微镜观察，确认细胞贴壁生长且呈轻微分支状。

观察细胞时，弃去含有非贴壁细胞的培养基。随后用IMDM洗涤贴壁细胞一次，并向培养瓶中加入30毫升新鲜的MSCF培养基。第10天时，用8毫升无酶的EDTA细胞解离缓冲液替换培养基以收集细胞。短暂孵育后，轻轻刮下细胞，并在显微镜下确认细胞是否已解离脱落。

细胞释放后，将含有细胞的缓冲液转移至50毫升锥形管中，再用5毫升IMDM冲洗培养瓶三次，以收集更多细胞。合并所有收集液，离心后将沉淀重悬于3毫升MCSF中。随后对细胞进行计数，并将其浓度调整至每毫升100万个细胞。

随后，将每孔100 µL细胞悬液接种至96孔平底板中。整个培养板应填满。培养细胞约1小时，直至细胞贴壁。然后用不同浓度的LPS或静脉注射用免疫球蛋白（IVIG），或两者联合处理细胞，这些试剂均用IMDM培养基配制。所有操作均需设2~3个复孔，并务必保留未处理的对照组。随后将细胞继续培养24小时，收集上清液进行分析。