小鼠模型中疫苗诱导免疫对细菌感染的评估

为了研究疫苗诱导的免疫反应，使用含有无细胞百日咳疫苗的注射器。该疫苗包含一种引起呼吸道疾病的细菌——百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）的抗原蛋白，以及可延长抗原暴露时间以维持免疫应答的佐剂。

将疫苗注射到麻醉小鼠的肌肉内。

注射后，组织中的抗原提呈细胞（APCs）会捕获抗原蛋白并将其加工成肽段，然后将其呈递于细胞表面。这些抗原提呈细胞随后迁移至邻近的淋巴结，与T细胞相互作用，启动T细胞的活化并分化为效应T细胞。

这些效应T细胞循环并迁移至包括肺在内的多个器官，并以驻留记忆T细胞或T_RM细胞的形式存在于其中，从而实现免疫保护。

免疫接种后，通过鼻内给予一种耐抗生素的活体百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）。这些细菌进入肺组织并激活组织驻留性T细胞（T_RM）。活化的T_RM细胞分泌炎性细胞因子，募集免疫细胞以清除细菌。

取小鼠的肺组织并进行匀浆处理，以获得单细胞悬液。将稀释后的细胞悬液接种于含抗生素的琼脂平板上，孵育以促进细菌菌落的形成。

与未免疫小鼠相比，免疫小鼠的组织提取物中菌落数量更少，证实该疫苗可诱导针对百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）的免疫反应。

进行免疫接种时，确认麻醉后的6至12周龄小鼠对脚趾夹捏无反应，用1毫升胰岛素注射器（配备28.5号针头）吸取0.1毫升目标疫苗。持注射器使针头斜面向上，与皮肤呈45度角，将针头插入小鼠三角肌约5毫米深处，然后注射疫苗。

将针头保留在肌肉内5到10秒。然后将注射器旋转180度，使针尖斜面朝下，以形成密封，防止在缓慢拔出针头前疫苗泄漏。随后，将小鼠放回笼中，并持续监测直至完全恢复。

加强免疫约两周后，感染已免疫的小鼠。抓住经麻醉小鼠肩胛骨后背部胸区的皮肤，将小鼠直立固定，以便接触鼻部。使用200微升移液器吸头，缓慢将20至25微升目标细菌接种物滴加至每只动物的鼻腔，保持小鼠直立直至全部接种物被吸入。随后，向一组小鼠给予等体积的无菌PBS作为阴性对照。

在适当的实验终点，将感染的小鼠仰卧位固定于解剖板上，并固定四肢。用70%乙醇润湿小鼠体表，用镊子夹住骨盆中央腹部下方的皮肤。使用锋利的剪刀从该处垂直剪至下颌，分离皮肤与腹膜壁。将皮肤向尸体两侧翻开，以获得无遮挡的无菌器官采集视野，然后抓住肋骨下方靠近肝脏处完整的腹膜。沿腹膜向肋骨方向剪开，暴露下消化道，并将结肠移向左侧，以显露脾脏。

使用弯头镊子夹住脾脏，并用剪刀剥离结缔组织。然后将脾脏置于含有 3 毫升 RPMI 和 5% 胎牛血清的 15 毫升锥形管中，冰上保存。用镊子在剑突处固定肋骨 cage，剪开膈肌。肺脏应随之塌陷并下垂至脊柱方向。

从两侧切开肋骨以移除胸骨，并切断肺动脉和静脉，分离并取出右肺的上叶。将肺叶置于含有15毫升10%中性缓冲福尔马林的锥形管中，在室温下固定至少24小时，然后分离右肺和左肺的其余肺叶。接着，将肺叶放入含有2毫升PBS中1%酪蛋白的15毫升锥形管中，置于冰上。

使用带有吸头的1毫升移液枪吸取充满胸腔的血液，并将血液转移至预贴标签并置于冰上的1.5毫升微量离心管中。去除腮腺、舌下腺和下颌下腺，以及覆盖气管的淋巴结，打开并移除包裹气管的保护膜。使用精细镊子和剪刀，从锁骨顶端至下颌底部，小心地将气管与食管及其他结缔组织分离。

用镊子夹住气管，并在锁骨顶端处剪断气管。向下牵拉气管以最大程度地伸展其弹性，然后在下颌骨底部、喉部正上方剪断气管，分离出约1厘米长的组织。随后，将器官置于预标好的1.5毫升离心管中，管内含有0.3毫升含1%酪蛋白的PBS溶液，并置于冰上。

现在，将小鼠翻转以充分暴露鼻部，并用70%乙醇喷洒头部。用手紧握动物颅骨后方，使用剪刀从鼻尖底部开始向上剪除吻部的软组织。清除鼻周的毛发、皮肤和触须，将一对弯头剪刀的尖端插入鼻孔，弯曲方向朝下。

沿鼻腔向眼部方向剪开，形成类似“V”字的结构。然后用精细镊子采集鼻中隔及该结构内的软组织，并将组织置于预标记的1.5毫升微量离心管中，管内含0.3毫升含1%酪蛋白的PBS溶液，冰上保存。

处理肺组织时，将整个肺组织样本管中的内容物转移至一个无菌的15毫升Dounce匀浆器中，使用研杵匀浆组织。持续解离样本直至无明显组织大颗粒存在，然后将匀浆后的悬液转移回原来的15毫升离心管中。取出0.3毫升等分试样用于菌落形成单位的涂布，其余匀浆液通过离心收集。

取0.5毫升上清液，分装至预先标记的微量离心管中，于-20摄氏度保存，直至通过ELISA检测细胞因子表达水平。随后，将预留的肺组织匀浆悬液取0.1毫升，每份用0.9毫升无菌PBS进行系列稀释，每次稀释后使用无菌三角涂布棒取0.1毫升，接种于预先标记的含链霉素的10% Bordet-Gengou平板上，每个稀释度选择根据经验确定的适当稀释浓度进行涂布。