通过细胞内染色与流式细胞术分析烟草制品制剂对细胞因子产生的影响

当与炎性刺激物相互作用时，免疫细胞会释放炎性信号分子——细胞因子，以产生免疫反应。

为了分析烟草制品制剂（TPPs）的作用，取一块含有浓度递增的TPPs的多孔板。将含免疫细胞的人类外周血单个核细胞（PBMCs）接种到该板中。

尼古丁——烟草制品（TPPs）中的一种免疫抑制剂——可与烟碱型乙酰胆碱受体结合，下调促炎性细胞因子的产生。这种下调作用具有剂量依赖性，浓度越高，抑制效应越显著。

离心以沉淀细胞，并弃去含有TPP残留物的上清液。

用完全培养基重悬细胞，并加入含有脂多糖（一种免疫刺激剂）和GolgiPlug（一种蛋白质转运抑制剂）的混合物。

脂多糖分子与含有Toll样受体-4的免疫细胞相互作用，触发细胞内信号通路并促进促炎性细胞因子的产生。与此同时，GolgiPlug分子阻断细胞因子从高尔基体的分泌，使其得以积累。

用固定液固定细胞，并使用成孔试剂对细胞进行透化处理。将荧光标记的抗细胞因子抗体混合液覆盖于细胞上，抗体通过孔道进入细胞内，与相应的胞内细胞因子结合。

通过流式细胞术分析染色后的细胞，该技术用于检测荧光信号。

确定细胞因子的产生水平；剂量依赖性的降低表明 TPPs 具有免疫抑制作用。

开始染色程序前，用完全RPMI培养基将全烟雾条件培养基和尼古丁稀释至列表中的浓度，在96孔板中每孔总体积为100微升。然后，向每孔加入100微升以1×10⁶个细胞/孔浓度悬浮于完全培养基中的外周血单个核细胞（PBMCs），使每孔总体积达到200微升。接着，盖好培养板，并在37摄氏度、5% CO₂条件下孵育。

孵育三小时后，洗涤细胞并吸除上清液。然后再次覆盖培养板，涡旋震荡以分散沉淀。再用预冷的运行缓冲液和完全培养基各洗涤细胞一次，共洗涤两次。

第二次洗涤后，每孔加入200微升完全培养基，同时添加GolgiPlug和LPS，在37摄氏度、5% CO₂条件下处理6小时。随后，用预冷的流式洗涤缓冲液洗涤细胞，每孔加入100微升Cytofix，在4摄氏度下处理。20分钟后，用预冷的破膜洗涤缓冲液洗涤细胞三次。

然后，向每孔加入 45 µL Cytoperm，随后加入所列的每种抗体各 5 µL。在 4 °C 孵育 30 分钟后，洗涤细胞三次，并将细胞重悬于 200 µL 冰冷的 2% 多聚甲醛中进行固定。接着，将细胞转移至 12 × 75 mm 的流式管中，使用流式细胞仪分析样品。