金黄色葡萄球菌体外生物膜合成

细菌生物膜是由嵌入自生成的细胞外基质中的细菌群落组成的三维结构，可逃避宿主免疫反应。

对于体外金黄色葡萄球菌生物膜制备，将所需细胞密度的活跃生长的金黄色葡萄球菌悬浮液转移到多孔板的聚-L-赖氨酸包被孔中。

在静态条件下孵育过程中，带正电荷的聚-L-赖氨酸涂层促进与细菌表面带负电荷的糖聚合物（如磷壁酸）发生静电相互作用，促进细菌附着。

有了可用的营养来源，金黄色葡萄球菌就会分裂和积累，形成微菌落。此外，细菌还分泌由多糖、蛋白质和细胞外DNA组成的细胞外基质，包裹细胞并促进细菌内聚力和表面粘附。

随着细胞分裂和基质分泌的持续，生物膜成熟成三维结构，具有有效的信号分子分布，用于细胞间通讯。

当达到阈值细菌密度时，金黄色葡萄球菌会分泌蛋白酶和核酸酶，降解生物膜基质并将一些金黄色葡萄球菌释放到培养基中。去除含有自由漂浮浮游细菌的培养基。

轻轻添加缓冲液以防止生物膜破坏。除去含有任何剩余未附着细菌的缓冲液。

生成的生物膜已准备好用于下游实验。

首先，在营养丰富的琼脂平板（如胰蛋白酶大豆琼脂）上使用条纹板技术从冷冻保存的储备中获得分离的金黄色葡萄球菌菌落。用在无菌水中稀释的 100 微升 PLL 包覆 96 孔板的各个孔，并在室温下孵育 30 分钟。使用真空辅助抽吸陷阱无菌吸出PLL溶液。让孔在室温下干燥过夜。

通过在补充有2%葡萄糖的MEM-α中接种金黄色葡萄球菌菌落来制备过夜培养物，并在37摄氏度下以每分钟200转的速度孵育16至18小时。通过将 50 微升转移到 5 毫升补充有 2% 葡萄糖的新鲜 MEM-α 中来稀释过夜培养物。然后，在37摄氏度下以每分钟200转的速度孵育，直到达到中对数相。使用MEM-α将中对数培养物归一化至OD为0.1。

将 150 微升标准化培养物转移到 PLL 处理的 96 孔板的每个孔中。将板在37摄氏度的加湿室中孵育18至20小时。吸出上清液以去除浮游细胞。轻轻地，用 150 微升 HBSS 洗涤剩余的生物质，以去除未附着的细胞。重复至少两次以去除所有浮游细胞。