0 次观看 • 3:23 分钟 • July 8th, 2025
为了通过流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）——一种致病性细菌——刺激淋巴细胞，需取含有淋巴细胞和抗原呈递细胞（APC）的分离外周血单个核细胞（PBMC）悬液。
加入细菌悬液，并在生理温度下孵育。
抗原提呈细胞上的模式识别受体与细菌细胞的特定组分结合，触发吞噬作用。含有被内化细菌的吞噬体与溶酶体融合，导致细菌降解并被加工成肽段片段。
主要组织相容性复合体（MHC）分子与肽片段结合，并将其作为抗原呈递在细胞表面。T淋巴细胞与所呈递的抗原结合。 通过 T细胞受体
加入可结合T淋巴细胞表面特异性受体的共刺激抗体。协同结合可诱导下游信号转导，激活T淋巴细胞的细胞因子产生。
加入高尔基体阻断剂——阻断从内质网到高尔基体的囊泡蛋白运输——以抑制T淋巴细胞的细胞因子分泌，促进细胞内细胞因子的积累。
加入固定剂以保存细胞形态，加入去垢剂以通透细胞膜。加入荧光标记抗体的混合物，包括可结合T淋巴细胞特异性表面标志物的抗体——用于标记细胞表面——以及可进入细胞内并结合细胞内细胞因子的细胞因子特异性抗体。
通过流式细胞术检测具有双重荧光的细胞——以指示经刺激的T淋巴细胞产生的细胞因子。
将外周血样本分装成等份，分别用于对照和抗原刺激。向两份样本中均加入共刺激抗体，然后向抗原样本中加入非分型流感嗜血杆菌（H. influenzae），并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。
接下来，向样品中加入高尔基体阻断剂布雷菲德菌素A，混匀后继续孵育5小时。按照之前的方法裂解红细胞后，使用500微升浓度为1%至2%的多聚甲醛固定白细胞，固定时间为1小时。用血细胞计数板对细胞进行计数，随后用100微升浓度为0.1%的皂苷处理100万个细胞，透化15分钟。
接下来，将细胞与适当的荧光标记抗体孵育。洗涤细胞后，使用流式细胞仪进行分析。通过圈选相关的淋巴细胞群体，确定抗原应答细胞的比例。对所有待分析的细胞因子，均需对未刺激的细胞进行背景染色。