感染的人体组织来源细胞中炎症介质的定量

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感染期间,活化的淋巴细胞会释放炎症介质(细胞因子)以引发免疫反应。

要量化受感染组织中的炎症介质,请从含有人肺组织衍生免疫细胞的细胞悬液开始。

细胞与流感嗜血杆菌(一种呼吸道致病菌)一起孵育。细菌的表面抗原与吞噬免疫细胞上的模式识别受体相互作用。这启动细菌内化,加工成更小的肽,以及主要组织相容性复合物分子呈递肽。

吞噬细胞上的抗原-MHC-II分子通过T细胞受体与T淋巴细胞结合,并伴有共刺激受体相互作用,导致T淋巴细胞活化和促炎细胞因子的产生。

用高尔基体阻滞剂处理细胞,损害细胞因子的释放——导致它们在细胞内积累。用封闭缓冲液洗涤细胞以阻断非特异性结合位点。

用荧光团标记的抗体混合物对细胞悬液进行染色,这些抗体与人 T 淋巴细胞表面标记物特异性结合,从而实现淋巴细胞的标记。

固定细胞,并用成孔表面活性剂对其进行透化。将透化细胞与荧光团标记的抗细胞因子抗体一起孵育,这些抗体进入细胞并与特定细胞因子相互作用。

使用流式细胞术测量标记淋巴细胞内的细胞因子荧光信号,与细菌感染引起的炎症介质产生相关。

约 20 至 40 克肺叶切除术样品切成 3 至 5 立方毫米的切片。将它们放入无菌的 50 微升室中,并使用适当的分解器机械地碎裂组织。组织分解后,如图所示裂解红细胞,并将细胞重悬于无菌RPMI中。然后,通过100微米无菌尼龙网过滤细胞,并使用台盼蓝排除法计算活细胞的数量。

对于感染测定,将肺细胞重悬于RPMI中,至每管每毫升400万个细胞的终浓度。然后,以每个细胞 100 个细菌的 MOI 感染细胞。松开盖子半圈,以允许气体在管中转移。将细胞放入管旋转器中,并在 37 摄氏度下孵育,同时以 12 RPM 旋转。刺激后一小时,加入Brefeldin A以防止细胞因子的细胞外输出,并将细胞悬液轮换孵育16至22小时。

第二天,用含有1%牛血清白蛋白和0.01%叠氮化钠的500微升PBS洗涤细胞悬液。接下来,在细胞悬液中停留一小时,以寻找特定的人淋巴细胞表面标志物。然后,用PBS洗涤细胞并固定和透化它们,如前所述。接下来,将细胞与细胞内细胞因子染色抗体孵育一小时。然后,洗涤细胞并将其重悬于 100 微升 PBS 中,然后在流式细胞仪上采集数据。

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Last updated: 18 July 2026