中性粒细胞与调理化生物膜相互作用后活性氧产生的测定

被调理素标记的细菌可被中性粒细胞上的特异性受体识别，从而触发吞噬作用，并释放活性氧（ROS），导致细菌降解。

定量中性粒细胞活性氧的产生 体外，取一个多孔板。测试孔中含有一个 金黄色葡萄球菌 由嵌入胞外基质膜中的细菌组成的生物膜。对照孔不含生物膜。

将生物膜与人血清孵育，使血清调理素对生物膜进行调理。

吸弃血清。用缓冲液洗涤，去除未结合的调理素。向孔中加入中性粒细胞和鲁米诺——一种化学发光化合物。离心，使中性粒细胞靠近生物膜。

使用酶标仪随时间测量发光量。

在含有生物膜的孔中，中性粒细胞与生物膜上的调理素结合，导致中性粒细胞活化以及细菌被内化至吞噬体中。特定的信号通路被激活，促使NADPH氧化酶在吞噬体上组装。 

NADPH 氧化酶催化电子从 NADPH 转移至分子氧，产生可降解细菌的活性氧（ROS）。此外，细胞膜上的 NADPH 氧化酶可将活性氧（ROS）释放到细胞外。

作为应对，生物膜细菌会产酶以中和活性氧（ROS），并释放白细胞溶素，后者可在中性粒细胞膜上形成孔道，导致细胞裂解，从而破坏ROS的生成。鲁米诺可与ROS发生反应，使其激发，并在退激时发出化学发光。

与对照组相比，实验孔中活性氧水平升高，表明中性粒细胞调理的生物膜发生了相互作用。

将用 HBSS 稀释的 100 微升 20% 正常人血清逐滴加入洗涤后的生物膜中，在 37°C 下孵育 30 分钟，以对生物膜进行调理（opsonize）。吸除血清溶液，并用 150 微升 HBSS 逐滴洗涤生物膜。吸除 HBSS，保留含有已调理生物膜的孔。

将鲁米诺加入用 HBSS 重悬的中性粒细胞中，使鲁米诺的终浓度为 5 微摩尔。此溶液可用于 A 组和 C 组。将含有鲁米诺的中性粒细胞加入含有调理化生物膜的孔中。

对于 D 组，在另一支试管中用 HBSS 配制 50 微摩尔的鲁米诺溶液，不添加任何中性粒细胞，然后将其加入含有生物膜的孔中。取 350 微升与鲁米诺混合的中性粒细胞，向该混合物中加入 PMA，使其终浓度为 500 纳克/毫升。

对于B组，将此混合物中的中性粒细胞加入无生物膜的孔中，作为阳性对照。在4摄氏度下，以270 RCF离心90秒。确保酶标仪设置为37摄氏度，并以3分钟为间隔，对发光信号进行持续60分钟的动力学读数。

将培养板放入酶标仪中，测量中性粒细胞在60分钟内的活性氧产生情况。