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生物膜是一类由嵌于微生物来源的胞外多聚物基质(EPS)中的附着于表面的细菌群体所构成的群落。
研究免疫细胞与生物膜的相互作用 体外 取一个载玻片,其通道内含有生物膜 金黄色葡萄球菌 —一种机会性致病菌。经基因工程改造的细菌表达荧光蛋白,可用于显微检测。通道连接至含有培养基的储液池,为细菌提供营养物质。
加入用荧光细胞示踪染料标记的中性粒细胞悬液。培养基中还含有溴化乙锭同二聚体,可对死细胞的DNA进行染色。在生理条件下孵育。
中性粒细胞上的模式识别受体与细菌的病原体相关分子模式结合。该结合可诱导中性粒细胞吞噬细菌,并产生胞外活性氧(ROS)。, 杀死细菌。
为逃避免疫反应,细菌会释放解毒酶,以降低活性氧(ROS)和导致细胞死亡的白细胞毒素。单体形式的白细胞毒素与中性粒细胞上的特异性受体结合,并通过多聚化形成孔道,破坏细胞膜完整性,从而杀死细胞。
碘化丙啶二聚物通过受损的细胞膜进入,使死细胞着色。
在宽场荧光显微镜下,部分细菌细胞和中性粒细胞呈现死亡状态,表明中性粒细胞与生物膜之间存在相互作用。
使用表达 GFP 的荧光金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株(例如 USA300)以方便显微镜成像。将中性粒细胞与 100 µM BCD 在 37°C、5% CO₂ 条件下于摇床中孵育 30 分钟。确保样品在避光条件下孵育,并尽量减少光照暴露。
为洗去多余的 BCD,将中性粒细胞在 270 RCF 下离心五分钟,并吸除上清液。用新鲜的 HBSS 重悬中性粒细胞。然后,向经 BCD 染色的中性粒细胞中加入碘化丙啶同源二聚体-1(ethidium homodimer-1),终浓度为 4 微摩尔(micromolar),用于监测中性粒细胞和细菌的死亡情况。
用HBSS清洗生物膜,并向微滑片中生长的S. aureus生物膜加入150微升中性粒细胞。将微滑片置于湿化 chamber 中孵育30分钟。细菌细胞的数量将依据18小时生物膜平板获得的细胞计数确定。
使用与荧光染料或蛋白质激发和发射波长相对应的荧光通道,对中性粒细胞与生物膜的相互作用进行成像。