研究中性粒细胞和生物膜之间相互作用的体外测定

生物膜是嵌入微生物来源的细胞外聚合物物质 EPS 基质内的表面粘附细菌群落。

要在体外研究免疫细胞-生物膜相互作用，请使用含有金黄色葡萄球菌（一种机会性病原体）生物膜的通道进行载玻片。工程细菌表达荧光蛋白以进行显微镜检测。该通道连接到装满培养基的储液器，为细菌提供营养。

加入用荧光细胞示踪染料标记的中性粒细胞悬浮液。该培养基还含有乙锭同源二聚体，可对死细胞的 DNA 进行染色。在生理条件下孵育。

中性粒细胞上的模式识别受体与细菌上的病原体相关分子模式结合。结合诱导中性粒细胞吞噬细菌并产生细胞外活性氧或 ROS，从而杀死细菌。

为了逃避免疫反应，细菌会释放解毒酶，减少导致细胞死亡的 ROS 和杀白细胞毒素。单体白细胞杀白细胞与中性粒细胞上的特定受体结合并经历多聚化形成孔，破坏膜完整性并杀死细胞。

乙锭同源二聚体通过受损的细胞膜进入，对死细胞进行染色。

在宽视场荧光显微镜下，细菌细胞和中性粒细胞的子集似乎死亡，表明中性粒细胞-生物膜相互作用。

使用金黄色葡萄球菌荧光菌株，例如表达 GFP 的 USA300，以简化显微镜成像。将中性粒细胞与 100 微摩尔 BCD 在 37 摄氏度的摇杆中孵育 30 分钟，并含有 5% 的大气二氧化碳。确保样品在黑暗中孵育并限制光照。

要洗涤多余的BCD，请在270 RCF下离心中性粒细胞5分钟，然后吸出上清液。将中性粒细胞重悬于新鲜的HBSS中。然后，将乙锭同源二聚体-1以终浓度为4微摩尔的BCD染色的中性粒细胞加入，以监测中性粒细胞和细菌死亡。

用HBSS洗涤生物膜，并将150微升中性粒细胞添加到在微载玻片中生长的金黄色葡萄球菌生物膜中。将微载玻片在加湿室中孵育30分钟。细菌细胞的数量将基于从 18 小时生物膜铺板中获得的细胞计数。

使用与荧光染料或蛋白质的激发和发射波长相对应的荧光通道对中性粒细胞生物膜相互作用进行成像。