通过暴露于烟草制品处理的外周血单个核细胞杀伤K562细胞

肿瘤细胞激活效应免疫细胞，使其释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞因子和细胞溶解颗粒。穿孔素在肿瘤细胞膜上形成孔道，促进颗粒酶进入细胞，启动凋亡过程，导致细胞死亡。

为了分析人外周血单个核细胞（PBMCs）在烟草制品处理物（TPP）暴露后的细胞毒性功能，取一个多孔板，其中含有递增浓度的TPP。含培养基的孔作为对照。

加入PBMC悬液。TPP的主要免疫抑制剂尼古丁可结合效应PBMC的烟碱型乙酰胆碱受体，从而下调促炎性细胞因子的产生。

离心。移除含有TPP的上清液。用培养基重悬PBMCs。向孔中加入荧光标记的K562细胞，即对PBMC效应细胞毒性具有增强易感性的人类白血病细胞。 

经TPP处理的效应细胞免疫应答受到抑制，表现为穿孔素表达降低和细胞因子释放减少，从而减弱了PBMC的细胞溶解能力。

离心。将细胞重悬于缓冲液中，随后加入一种不能透过完整细胞膜的荧光染料。该染料可进入细胞膜受损的细胞，并对DNA进行染色。

使用流式细胞仪测定各孔中死亡和存活的 K562 细胞比例。若 TPP 浓度较高的孔中死亡 K562 细胞百分比较对照组更低，则表明经 TPP 处理的 PBMCs 抑制了对 K562 细胞的杀伤作用。

按照上述方法制备经烟草产品处理的PBMCs后，用10毫升DPBS洗涤在80%汇合度下收获的K562细胞培养物。将细胞沉淀重悬于5毫升DPBS中，并进行细胞计数。随后，向1毫升完全培养基中的1至2×10⁷个K562细胞加入1毫升新鲜配制的CFSE工作液，并通过涡旋振荡分散细胞染料。

将细胞在室温下孵育。精确孵育2分钟后，加入200 µL FBS，并再次涡旋混匀细胞，继续孵育2分钟。

第二次孵育后，用10毫升完全培养基洗涤细胞。然后将沉淀重悬于另外10毫升完全培养基中，并计数细胞。现在，离心烟草处理的外周血单个核细胞（PBMCs），弃去上清液。随后盖上盖子，通过涡旋振荡重悬细胞，并在每孔200微升完全培养基中洗涤细胞。

启动杀伤实验时，按1:15的比例将CFSE标记的K562细胞加入PBMCs中，并在37°C、5% CO2条件下孵育共培养体系。

孵育5小时后，离心沉淀细胞并弃去上清液。通过涡旋振荡重悬沉淀，然后每孔加入200微升运行缓冲液洗涤细胞。随后，每孔加入95微升运行缓冲液和5微升7-AAD，总体积为每孔100微升。

最后，将细胞在室温避光条件下孵育15分钟，然后每孔加入100 µL运行缓冲液，混匀后将全部液体转移至相应的FACS管中，通过流式细胞术分析7-AAD和CFSE阳性细胞的百分比。