一种用于研究抗菌治疗对细菌聚集体作用的体外技术

为了研究抗菌剂对细菌聚集体的影响，需在促进聚集体形成的培养基中培养铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），以模拟感染过程中的生长状态。

经基因工程改造的细菌表达一种荧光蛋白，可在荧光显微镜下用于检测聚集体。通过三维成像计算聚集体或细菌生物量的体积，并可视化生物量随时间的增加，以指示细菌生长。

加入亚致死浓度的多粘菌素（一种阳离子抗菌肽），以杀死敏感细菌，同时筛选出对抗生素耐受的细菌。

多粘菌素结合细菌外膜上带负电荷的脂多糖（LPS），取代稳定LPS单层结构的阳离子桥，从而破坏膜的完整性。

多粘菌素进入周质空间并与细胞膜上的脂多糖（LPS）结合，破坏膜结构，导致细胞裂解。作为一种应对机制，部分细菌会发生特定的基因突变，中和LPS的负电荷。这种修饰抑制了带正电荷的多粘菌素与负电荷减少的LPS之间的静电相互作用，从而阻止细胞死亡。

图像显示随着时间推移生物量减少，表明抗菌剂的作用效果。加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）——一种可穿透受损细胞膜并与DNA结合的荧光染料，仅对死细胞进行标记。

进行荧光激活细胞分选（FACS），分离经PI标记的敏感细胞和荧光标记的抗生素耐受细胞。这些细胞已准备好用于后续分析。

为了通过共聚焦激光扫描显微镜观察铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）聚集体，在孵育结束时，将培养板中的三个孔指定为抗生素处理的重复孔，另设一个孔作为“无处理对照”，并将培养板放置于显微镜的加热载物台上。

选择63倍油浸物镜，打开定位选项卡，在明场中识别细菌聚集体。在每个孔内定义成像区域，并使用位置模块保存该区域位置。将激发波长设置为488纳米，发射波长设置为509纳米。

在采集模块中，选择Z-层扫描选项以获取图像，并使用线平均模块降低Z-层扫描图像总体积中GFP通道的背景荧光。设置时间序列选项，以每15分钟一次的频率，在18小时内对每个孔采集60个层面，并采用确定性聚焦策略，为每个位置存储一个焦平面，以便在整个实验过程中每个时间点重新成像。

在设置成像实验后4.5小时，对每个位置进行成像，以确定在添加抗生素之前四个孔中各自的聚集体生物量。六小时后，将抗生素轻轻添加至每孔中间，浓度为最低抑菌浓度的二分之一，位置紧靠气液界面下方，然后单击开始实验，以启动抗生素处理后的成像过程。

为了分离活细胞，在18小时成像期结束时，根据生产商的建议，用适当体积的碘化丙啶对每个孔中的细菌进行标记。孵育结束后，使用隔热容器将培养板转移至流式细胞仪，并将细胞仪设置为使用70微米喷嘴检测GFP和碘化丙啶。然后，以最低流速分别运行每份培养上清液1毫升的等分试样，以分选具有活性的GFP阳性及无活性的碘化丙啶阴性Pseudomonas aeruginosa聚集体。