菌落形成单位法测定宿主细胞内细菌感染量

为了开始菌落形成单位（CFU）实验以定量活菌数量，取一块含培养于生长培养基中的多孔板巨噬细胞。用单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）感染巨噬细胞，该病原菌具有胞内生长能力。

感染过程中，巨噬细胞吞噬细菌，将细菌包裹在由膜包被的区室——吞噬体中。

细菌分泌一种孔形成毒素并破坏吞噬体膜，从而使细菌得以进入胞质溶胶并在巨噬细胞内复制。

用庆大霉素短暂处理感染的巨噬细胞，该抗生素可选择性清除未被内化的细菌，同时保留细胞内细菌。

吸去含有抗生素的上清液。随后，在感染的巨噬细胞上加入无菌蒸馏水，形成低渗环境。这会引发渗透作用，水分子进入细胞，导致巨噬细胞裂解，释放胞内组分，包括细菌。

将含有胞内细菌的细胞裂解液涂布于溶菌性琼脂平板上，以促进单个细菌细胞的分离并使其独立生长。在培养过程中，有活力的细菌在琼脂表面生长并形成明显的菌落。

计数平板上的菌落并获得菌落形成单位（CFU），代表逃逸宿主免疫反应并在感染的巨噬细胞内成功复制的胞内细菌。

收获时，轻轻倾斜培养皿，用移液器小心吸除孔中的全部培养基。向孔中加入 0.5 毫升无菌蒸馏水。30 秒后，将所得的水裂解液转移至 1.5 毫升微量离心管中，并剧烈涡旋振荡 10 秒。

取4.5微升和50微升水裂解液，分别加入450微升无菌蒸馏水中，制备10倍和100倍稀释液。短暂涡旋振荡以确保充分混匀。将50微升原始的10倍稀释和100倍稀释样品分别加至LB（Lysogeny Broth）琼脂平板上，使用涂布棒均匀涂布。

为了检测新出现的Lm，从培养皿中吸取10微升上清培养基，分装到两个微量离心管中，每管5微升。向其中一份样品加入5微升DMEM/FCS，向另一份样品（对照）加入5微升含有5微克/毫升庆大霉素的DMEM/FCS。

在室温下静置5分钟。向每份等分试样中加入90 µL无菌蒸馏水，剧烈涡旋振荡试管10秒。然后，取50 µL样品加入LB琼脂平板，使用涂布棒均匀涂布。将平板置于37°C培养箱中培养两天，然后对Lm菌落进行计数。