0 次观看 • 4:21 分钟 • July 8th, 2025
取一个含巨噬细胞培养物的多孔板。用表达荧光蛋白的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）进行感染。
Lm 上的蛋白质与巨噬细胞上的特异性受体结合，使细菌被内化至吞噬体中。此外，Lm 分泌可形成孔道的毒素，破坏吞噬体膜，使细菌释放到胞质溶胶中，在此处细菌进行复制并被宿主肌动蛋白丝所包围。
单核细胞增生李斯特菌（Lm）表面的肌动蛋白组装诱导蛋白 ActA 可在细菌的后端持续诱导肌动蛋白聚合。所产生的肌动蛋白彗尾推动 Lm 穿越细胞质，并穿透巨噬细胞的细胞膜，将包裹着聚合肌动蛋白的 Lm 释放到培养基中。
孵育后，收集并固定一组孔中含细胞外、肌动蛋白结合的Lm的培养基。使用多聚甲醛固定Lm。加入蒸馏水，裂解巨噬细胞并释放胞内Lm。收集胞内Lm，并用多聚甲醛固定样本。
在其他孔中，更换为含庆大霉素的细胞非渗透性培养基，以清除细胞外的Lm。随后更换新鲜培养基，并孵育所需时间。
孵育结束后，收集细胞外产物 Lm含培养基中加入多聚甲醛固定样本，用蒸馏水制备含有细胞内成分的裂解液 Lm 用多聚甲醛固定样品。向样品中加入荧光标记的鬼笔环肽，该试剂可特异性结合聚合态肌动蛋白。
使用流式细胞仪检测样品中Lm和肌动蛋白结合型鬼笔环肽的荧光信号。定量分析感染巨噬细胞后来源于胞外和胞内的肌动蛋白结合型Lm。
使用自动细胞计数器，将制备好的 RAW 264.7 细胞调整至每毫升 1 × 106 个细胞的浓度。将 1 毫升样品加入 6 孔组织培养板的孔中。用制备好的 Lm 接种物感染细胞，感染复数为 50。
感染后1.5小时，在装有500微升4%多聚甲醛的1.5毫升微量离心管中收集第一组孔中的培养基，并将该管置于冰上。为收集细胞内 Lm，向每个孔中加入1毫升无菌蒸馏水。60秒后，将所得的水裂解液转移至含有500微升4%多聚甲醛的1.5毫升微量离心管中。剧烈涡旋震荡该管10秒，然后置于冰上。
对于其余孔，吸除培养基，更换为1毫升含5微克/毫升庆大霉素的DMEM/FCS，以杀灭细胞外的Lm。立即将培养皿放回培养箱中。
30分钟后，吸除培养基，更换为不含庆大霉素的DMEM/FCS。再经过2小时和4小时后，分别第二次和第三次收集裂解液中的培养基至离心管中，并将离心管置于冰上冷却。以10,000 × g 离心7分钟。
使用移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀。向管中加入染色混合液，其中包含 50 µL 的 4% PFA 和 15 µL 鬼笔环肽（phalloidin），混匀以重悬各沉淀。将各管置于 4 °C 避光孵育 20 分钟。
孵育后，向每管中加入1毫升FACS缓冲液，用移液器上下吹打混匀。将各管放入离心机中，以10,000 × g离心 g 7 分钟。去除上清液，切勿扰动沉淀。
如需立即使用，请将每个沉淀重悬于400 µL FACS缓冲液中。若需保存以备后续分析，则向管中加入200 µL FACS缓冲液和200 µL 4%多聚甲醛（PFA），混匀以重悬沉淀。