无菌实验技术：平板接种方法

[旁白] 本实验方案在用于分离、扩增或计数细菌和噬菌体等微生物的平板接种方法中，采用了无菌操作技术。具体步骤包括：通过划线接种法分离细菌培养物中的单菌落；采用倾注平板法测定细菌浓度；以及利用涂布平板法对可存活的细菌菌落进行计数。通过软琼脂覆盖法可实现噬菌体的分离及噬菌斑的计数，而影印平板法则能够将细胞以相同的空间排列方式从一个平板转移至另一个平板。最终，这些技术在微生物培养中的实际应用范围广泛，涵盖环境样本中细菌的鉴定，到分子遗传学和高通量生物测定领域的技术进步。

— 通常，初次接触这些涂布方法的研究人员可能会感到困难，因为操作过程需要谨慎且协调的动作，以避免接触到非无菌表面。掌握这些常规操作需要经过培训和练习。本次操作演示将由我的实验室主管 Kris Reddi 博士进行。

— [旁白] 开始进行微生物实验前，需了解实验室规则和安全预防措施，包括生物危害分类、废弃物的去污与处理。确认所有用于平板操作的仪器、溶液和培养基均为无菌状态，并建立一个整洁的工作区域，用消毒剂清洁台面。安装本生灯并连接气体管道，将所需物品有序摆放，标签清晰。随后用抗菌肥皂和温水彻底洗手：首先用流动的温水润湿双手，涂抹肥皂并充分揉搓，用力摩擦所有部位，包括拇指、手指背面、手背以及指甲下方。然后彻底冲洗以去除残留肥皂，并用从分配器中取出的纸巾擦干。最后，用一张新的纸巾关闭水龙头。划线平板法旨在通过简单的机械分离，从混合菌群中分离出纯的细菌培养物或单个菌落。从4°C冰箱中取出一个琼脂平板，预热至室温。从可用的工具中选择一种用于平板划线的接种工具，确保平板干燥，皿盖上无冷凝水。在琼脂平板底部边缘处做好标记。熟练后，可在一个平板上处理多个样品。点燃本生灯以灼烧金属接种环：从距离金属环3至4英寸处开始，将金属丝置于本生灯蓝色锥体尖端（即火焰最热区域）。当金属环变红后，移动金属丝使火焰逐渐接近接种环。为冷却接种环，可将其轻触琼脂培养基边缘，发出嘶嘶声。随后用冷却后的接种环蘸取菌样。提起平板底部，将接种环在平板第一象限内从边缘向中心来回移动划线。将倒置的平板放回皿盖上。再次灼烧金属接种环。将培养皿旋转90度，用接种环从上一次划线末端开始，以前后方式穿过第一象限后半段划线，进入空白的第二象限。完成第二象限划线后，放下平板。重复此操作完成第三和第四象限的划线，避免接触第一象限。若使用无菌扁平牙签进行划线，应以拇指和无名指轻轻夹住牙签窄端，与培养基呈10至20度角，用宽端在各象限划线。每完成一个象限后，将平板倒置放回皿盖，并妥善处理使用过的牙签。随后将划线后的平板倒置培养。倾注平板法用于计数单个平板表面及琼脂内部的菌落形成单位总数。设定10分钟计时器，将18毫升55°C水浴中融化的琼脂培养基转移至48°C加热块中，平衡10分钟。在无菌培养皿底部做好标记，如适用，注明稀释倍数。将1毫升样品加入培养皿中央，盖上皿盖。取下融化的琼脂管盖，将管口通过火焰灭菌。小心将琼脂倒入培养皿中，盖上皿盖，通过轻轻旋转培养皿使样品与琼脂充分混匀。静置30分钟，待琼脂完全凝固。琼脂凝固后，将平板倒置并置于恒温培养箱中。涂布法旨在将小体积样品中的微生物均匀分布，使形成的菌落在琼脂表面分散生长。将平板平衡至室温并正确标记。将平板置于旋转平台上。用移液器吸取0.1毫升样品滴加至琼脂表面中央，盖上皿盖。将枪头弃入废液容器中。将金属涂布棒浸入盛有70%乙醇的烧杯中，确保涂布器底部及杆部约1英寸部分完全浸没，然后沥干。通过本生灯火焰点燃多余乙醇进行灭菌。打开琼脂平板皿盖，将涂布棒轻触靠近边缘的琼脂表面以冷却。缓慢旋转转盘，同时轻轻将涂布棒置于琼脂表面，利用前后移动动作在转盘旋转过程中将样品均匀涂布至整个平板。盖上皿盖，让样品充分吸收至少5分钟。随后将平板倒置培养。首先正确标记琼脂平板。打开平板皿盖。接着打开预灭菌玻璃珠容器，灼烧瓶口。小心将10至12颗无菌玻璃珠加入琼脂平板中。盖上平板皿盖，在盖上容器盖前灼烧玻璃珠容器瓶口。现在将样品滴加至琼脂中央。以水平方向轻轻摇晃玻璃珠7次，使样品均匀分散。若操作正确，过程声音类似摇动沙锤。将平板旋转60度，再次水平摇晃7次。再次旋转平板60度，重复摇晃操作。确认样品已被充分吸收后，将污染的玻璃珠倒入标有标记的收集烧杯中，烧杯内含10%次氯酸钠溶液。将平板倒置培养。噬菌斑分析法常用于检测和定量细菌噬菌体。将指示菌培养至对数生长期，并置于冰上保存。标记两个无菌微量离心管分别为“噬菌体”和“对照”，分别加入50微升噬菌体样品或缓冲液。轻轻涡旋摇动烧瓶中的菌液，取适量菌液转移至无菌试管中，轻柔涡旋混匀指示菌，然后向每个吸附管中加入500微升菌液。通过轻弹试管混匀。切勿涡旋或剧烈移液处理噬菌体样品。将噬菌体与细菌混合物在适合指示菌株的温度下孵育20分钟。同时，将两支软琼脂管从55°C水浴转移至48°C加热块中，平衡10分钟。标记两个无冷凝水、已预平衡至室温的营养硬琼脂平板。从加热块中取出一支软琼脂管，检查其温度是否适宜（不烫手）。将噬菌体吸附管中的混合物无菌转移至软琼脂管中。迅速在手掌间旋转混匀。一手持软琼脂管，另一手打开硬琼脂平板皿盖，立即将全部内容物倾倒至硬琼脂平板表面。快速而轻柔地晃动平板使混合物均匀铺展。盖上皿盖，将平板水平放置30分钟，直至软琼脂凝固。接着对对照吸附管重复上述操作：将对照混合物转移至另一软琼脂管，混匀后倾倒至另一硬琼脂平板，晃动并静置30分钟使其凝固。检查平板上噬菌斑的形成情况。为从异质混合物中分离单个噬菌斑，可用无菌牙签小心穿刺噬菌斑中心，将接种物转移至含100微升噬菌体缓冲液的无菌微量离心管中。通过连续稀释并重复噬菌斑分析3至6次，进一步纯化该裂解液。影印培养法利用可选择的表型特征，实现主平板与多个次级平板之间细胞生长情况的比较。在平板底部绘制网格，标记主平板，并对各格编号。使用无菌技术从烧杯中取出一支预灭菌牙签，用其蘸取细胞样品点种于每个方格中心，随后将牙签弃入适当的废弃物容器中。培养主平板。将主平板与所有次级平板叠放在一起，在平板底部侧面做方向标记。从包装中取出无菌天鹅绒布，将其放置于圆柱形支撑块上。安装固定架，使架上的标记与支撑块上的标记对齐。注意支撑块与固定架上的方向标记。取下主平板皿盖，对齐平板与支撑块上的方向标记。将平板缓缓放下，使琼脂表面接触天鹅绒布。用指尖轻而均匀地按压主平板背面，然后小心将其从支撑块上取下。确认细胞印记已留在天鹅绒布上。盖上主平板皿盖。随后依次对每块次级平板重复上述操作，利用主平板细胞在天鹅绒布上的印记，接种最多八块次级平板，按底物适宜性由低到高排列。最后作为阳性对照，在系列最后一块平板上使用所有测试菌株均能生长的琼脂培养基。用胶带将倒置的平板固定在一起并进行培养。检查次级平板上的生长情况。关闭本生灯，收拾所有实验用品。将受污染的实验服、玻璃器皿和危险废弃物放入指定的处理容器中。用消毒剂清洁工作区域。最后用抗菌肥皂和温水彻底洗手。粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一种革兰氏阴性、杆状的变形菌，可产生一种名为灵菌红素的红色色素。它常在浴室和淋浴帘上生长。在此示例中，划线平板法在第四象限成功获得单菌落。本例对从公共饮水机采集的水样中细菌进行分析，采用倾注平板法。注意观察菌落形态的差异：表面菌落较大且呈圆形，而部分表面菌落则非常小且形状不规则。涂布平板法是富集、筛选和筛选实验中的重要组成部分。例如，copacabana法是重组DNA技术中经典蓝白斑筛选的区分工具。T4噬菌体是一种感染宿主大肠杆菌（Escherichia coli）的烈性双链DNA噬菌体，可导致宿主细胞裂解并释放子代噬菌体。在EHA琼脂上进行的噬菌斑分析显示，噬菌体形成直径约1毫米的透明区域。在无感染性噬菌体颗粒存在时，细菌在软琼脂中形成浑浊的细胞悬液，无法观察到独立菌落。在软琼脂覆盖技术中，噬菌斑形态存在差异。例如，同一分枝杆菌宿主菌株在存在分枝杆菌噬菌体“破坏者”与分枝杆菌噬菌体MSSS时，表现出不同的噬菌斑形态。影印培养法的强大之处在于可同时筛选大量微生物。本例中，四种假单胞菌菌株被重复测试在三种不同碳源（乙酰胺、乳糖和甘氨酸）上的生长情况。主平板为完全YTA培养基，接种了如图所示的四种菌株。在补充单一碳源（乙酰胺、乳糖或甘氨酸）的最小MSA培养基影印平板上，各菌株表现出不同的生长模式。所有菌株均能在最后的阳性对照平板上生长，证实本系列中所有次级平板均成功接收到细胞转移。对这些影印平板结果的汇总分析，详细展示了对不同野生型菌株特征性生长需求的同步筛选。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在不污染培养基或培养物的前提下进行平板接种操作，并能够根据实验需求选择合适的平板接种方法。熟练掌握这些技术需要实践积累。然而，通过适当的训练，本视频中介绍的平板接种操作将在您进行实验室操作时变得得心应手。