通过荧光显微镜检测炎症小体的活化

为了检测NOD样受体P3（NLRP3）炎性小体的活化，取一个含有表达NLRP3蛋白的已活化巨噬细胞的多孔板。

用含有离子载体和甘氨酸的培养基处理细胞。离子载体可诱导钾离子外流，从而激活并促进NLRP3蛋白的寡聚化。寡聚化的NLRP3招募接头蛋白，促进前体caspase-1的结合，形成NLRP3炎症小体复合物。

在炎性小体上，近距离相互作用触发前体半胱天冬酶-1（pro-caspase-1）的自剪切，释放出有活性的半胱天冬酶，启动细胞焦亡和细胞核凝聚。此外，甘氨酸可稳定细胞结构，防止细胞裂解。

用含有caspase-1结合基团和荧光团连接的荧光报告探针处理巨噬细胞 通过 一个氨基酸序列。活化的caspase-1识别探针的氨基酸序列，并与其caspase结合基团结合，从而实现其可视化。

固定细胞，并用荧光染料染色细胞核。在荧光显微镜下成像。

计数细胞核呈蓝色浓缩、且含有激活型caspase-1绿色荧光灶的巨噬细胞，提示NLRP3炎性小体被激活。

首先，将接种在玻璃盖玻片上的LPS预刺激骨髓来源巨噬细胞的培养基更换为290微升DMEM-5培养基，每孔添加5微摩尔尼日里菌素（nigericin）和5毫摩尔甘氨酸。将24孔板放回细胞培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育60分钟，并在孵育开始15分钟后加入10微升30X FAM-YVAD-FMK。

孵育结束后，每孔加入1毫升预冷的PBS，洗涤3次，每次5分钟；冰上避光条件下，每孔加入250微升2%多聚甲醛固定细胞30分钟，并在最后5分钟加入适当的荧光核染料对细胞进行标记。

孵育结束后，用冷PBS清洗细胞三次，方法如前所述，然后在每张载玻片上加入7 µL抗荧光淬灭封片剂。将盖玻片覆盖在每张载玻片上，室温静置过夜使封片剂固化，随后用指甲油密封盖玻片边缘。

为了通过荧光共聚焦显微镜观察细胞，将未经处理的对照玻片放置在显微镜载物台上，并手动对细胞进行聚焦。根据显微镜查找表设置，调节偏移值，直至在未经处理的细胞中未观察到阳性探针信号。

接下来，使用尼日霉素处理的样本，找到一个同时包含探针染色阳性和阴性细胞的视野，将探针通道的成像平面调整至阳性染色信号最强的层面。然后调节增益，直至在细胞核凝聚的细胞中可见焦点信号，并在每张玻片上随机选取五个视野，以100倍总放大倍数获取图像。