通过荧光显微镜检测炎性小体激活

要检测NOD样受体P3或NLRP3，炎症小体激活，请取一个含有表达NLRP3蛋白的活化巨噬细胞的多孔板。

用含有离子载体和甘氨酸的培养基处理细胞。离子载体诱导钾离子外排，激活和寡聚 NLRP3 蛋白。寡聚化的 NLRP3 募集衔接蛋白，促进前半胱天冬酶-1 的结合，形成 NLRP3 炎性小体复合物。

在炎性小体上，接近触发半胱天冬酶-1前自裂解，释放活性半胱天冬酶，引发细胞焦亡和核凝结。此外，甘氨酸可以稳定细胞结构，防止细胞裂解。

用含有半胱天冬酶-1结合基团和通过氨基酸序列连接的荧光团的荧光报告探针处理巨噬细胞。活化的半胱天冬酶-1识别探针的氨基酸序列并与其半胱天冬酶结合基团结合，从而实现其可视化。

固定细胞并用荧光染料覆盖它们以染色细胞核。荧光显微镜下的图像。

计数具有蓝色浓缩细胞核和活化半胱天冬酶-1 的绿色荧光病灶的巨噬细胞，表明 NLRP3 炎症小体激活。

首先用每孔补充 5 微摩尔黑芝麻素和 5 毫摩尔甘氨酸的 290 微升 DMEM-5 培养基替换接种在玻璃盖玻片上的 LPS 引发的骨髓来源巨噬细胞的培养基。将 24 孔板放回细胞培养箱中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下烘烤 60 分钟，在前 15 分钟后加入 10 微升 30X FAM-YVAD-FMK。

育结束时，每孔用1毫升冷PBS洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟，并用每孔250微升2%多聚甲醛将细胞固定在冰上30分钟，避光，在最后五分钟内用适当的荧光核染料标记细胞。

孵育结束时，如刚才所示，用冷PBS洗涤细胞三次，并在每张载玻片中装载7微升抗褪色封固剂。在每张载玻片上放一个盖玻片，让封片介质硬化过夜，然后用指甲油密封盖玻片。

要通过荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像，请将未经处理的对照载玻片放在显微镜载物台上，并手动聚焦在细胞上。使用显微镜查找表设置，调整偏移量，直到在未处理的细胞中没有观察到阳性探针站立。

接下来，使用黑霉素处理的样品，找到一个包含探针染色阳性和阴性细胞的区域，并将探针通道的成像平面调整到阳性染色强度最高的平面。然后，调整增益，直到病灶在具有浓缩细胞核的细胞中可见，并以100倍的总放大倍率获得每张载玻片随机选择的五个区域的图像。