一种用于研究巨噬细胞中炎性小体复合物形成的体外技术

从含有原代巨噬细胞培养物的培养板开始。

引入可与巨噬细胞上的Toll样受体结合的细菌脂多糖（LPS），从而触发NLR家族含吡啶结构域蛋白3（NLRP3）的蛋白表达上调。

加入介导钾离子外流的离子载体。细胞质中钾离子浓度降低会激活NLRP3。活化的NLRP3发生寡聚化，并诱导接头蛋白的募集，后者进一步募集前体caspase-1，从而形成炎性小体。

自剪切将酶原caspase-1转化为活化的caspase-1，后者介导炎症性细胞死亡或称细胞焦亡。细胞焦亡过程中的DNA损伤可导致细胞核浓缩。

固定细胞并用去垢剂处理以使其通透化。

加入一种与炎性小体相关衔接蛋白结合的一抗，以及一种与一抗结合并带有荧光标记的二抗，从而对炎性小体进行标记。

加入荧光核酸染料以标记细胞核。在荧光显微镜下，细胞显示出浓缩的细胞核——表明发生焦亡——以及接头蛋白的聚集灶——表明炎性小体的形成。

对于尼日霉素处理细胞的免疫荧光化学分析，洗涤探针标记的细胞，并在冰上避光孵育细胞，每孔加入250 µL固定和透化溶液，孵育30分钟。

用新鲜洗涤缓冲液再洗涤巨噬细胞三次，每孔加入 250 µL 针对含 C 末端半胱天冬酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的一抗，冰上孵育 1 小时以标记细胞。

孵育结束后洗涤细胞，将样品加入250微升相应荧光标记的二抗，在冰上避光孵育1小时，并在最后5分钟内加入4微升适当的荧光核染色染料。

用预冷的洗涤缓冲液洗涤细胞3次后，取7微升抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上，按图示操作，随后通过荧光共聚焦显微镜观察巨噬细胞。