一种研究巨噬细胞中炎性小体复合物形成的体外技术

0 次观看3:06 分钟 • July 8th, 2025

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从含有原代巨噬细胞培养物的板开始。

引入细菌脂多糖 LPS,它与巨噬细胞上的 toll 样受体结合,触发蛋白质 NLR 家族含有吡林结构域 3 或 NLRP3 的上调。

添加介导钾离子外流的离子载体。胞质钾减少激活 NLRP3。活化的 NLRP3 寡聚化并诱导衔接蛋白的募集,衔接蛋白又募集半胱天冬酶原 1,形成炎性小体。

自身蛋白水解将半胱天冬酶前-1转化为活性半胱天冬酶-1,从而介导炎症细胞死亡或细胞焦亡。细胞焦亡过程中的 DNA 损伤导致核凝结。

固定细胞并用洗涤剂处理以使其透化。

添加与炎性小体相关衔接蛋白结合的一抗,以及与一抗结合的荧光标记二抗,标记炎性小体。

引入荧光核酸染色剂来标记细胞核。在荧光显微镜下,细胞显示浓缩的细胞核(表明细胞焦亡)和衔接蛋白的病灶(表明炎性小体形成)。

对于尼日草苷处理的细胞的免疫氟化学分析,洗涤探针标记的细胞,并将细胞在每孔250微升固定和透化溶液中孵育30分钟,避光。

用新鲜的洗涤缓冲液再洗涤巨噬细胞三次,并用每孔250微升含有C端半胱天冬酶募集结构域(ASC)的细胞死亡相关斑点样蛋白一抗标记细胞,在冰上持续一小时。

孵育结束时洗涤细胞,并用250微升适当的荧光染料偶联二抗标记样品在冰上再停留一小时,在最后5分钟内加入4微升适当的荧光核染色染料。

在冷洗缓冲液中洗涤细胞3次后,如图所示,用7微升防褪色封固剂将盖玻片安装到载玻片上,并通过荧光共聚焦显微镜对巨噬细胞进行成像。

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最后更新:1 八月 2026