一种乳酸脱氢酶释放检测法用于检测尼日尔霉素暴露后巨噬细胞的死亡

取一块含有经脂多糖预处理的巨噬细胞的检测板。

启动可增加非活性促炎性细胞因子前体和NLRP3蛋白的表达。

加入尼日利亚菌素（nigericin），一种促进钾离子外流的离子载体。这会破坏细胞内钾离子水平，从而激活NLRP3蛋白，形成大型复合物。

寡聚化的NLRP3招募接头蛋白ASC，导致其发生聚合。ASC纤维进一步招募前体caspase-1，形成NLRP3炎症小体，即一种多蛋白复合物。

前体caspase-1发生邻近诱导的自激活，生成caspase-1。caspase-1 切割前炎症细胞因子和gasdermin-D蛋白，形成细胞膜孔道。

这会导致细胞因子分泌和炎症性程序性细胞死亡（即细胞焦亡），释放细胞内含物，包括乳酸脱氢酶（LDH）。收集含有LDH的上清液。

加入底物混合物——乳酸、碘硝基四氮唑紫（INT染料）、NAD+ 和 甲臜脱氢酶。LDH 将乳酸氧化为丙酮酸，同时还原 NAD+。甲臜脱氢酶催化 INT 还原，生成红色的甲臜。

颜色强度对应于LDH的释放量，升高水平表明与细胞焦亡相关的细胞损伤和死亡增加。

进行LDH释放实验时，向每个实验孔中加入50微升添加了10微摩尔尼日里菌素的DMEM-5培养基，向自发释放对照孔和100%裂解对照孔中各加入50微升DMEM-5培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育60分钟。孵育30分钟后，向100%裂解对照孔中加入10微升10倍裂解缓冲液，向其他孔中加入10微升培养基。孵育结束后，将培养板离心，然后从每孔中转移50微升上清液至透明平底板中。

随后，向每个孔中加入 50 µL 新鲜解冻并配制好的底物，避光孵育 30 分钟，在孵育 15 分钟后检查平板，以确认信号不会超过酶标仪的检测限。孵育结束后，向每个孔中加入 50 µL 终止液，并使用合适的酶标仪测定 OD₄₉₀，以便计算每孔的细胞裂解百分比。