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从
含有荧光标记的中性粒细胞的多孔板开始,并用含有抗中性粒细胞细胞质抗体的患者血清进行处理。
这些抗体与中性粒细胞的 Fc 受体相互作用,激活信号通路,产生活性氧或 ROS,并激活肽基精氨酸脱亚胺酶。
ROS 引起中性粒细胞脱颗粒,将酶——弹性蛋白酶和髓过氧化物酶释放到细胞质中。这些酶和活化的肽基精氨酸脱亚胺酶易位到细胞核。
弹性蛋白酶裂解组蛋白-H1,髓过氧化物酶修饰组蛋白,启动染色质去浓缩。活化的肽基精氨酸脱亚胺酶诱导组蛋白瓜氨酸化,将精氨酸残基转化为瓜氨酸并有助于进一步去冷凝。
去浓缩的染色质与细胞内蛋白质混合,包括抗菌蛋白和细胞质蛋白。随后,中性粒细胞膜崩解,将与细胞质蛋白混合的去浓缩染色质释放到细胞外空间,形成中性粒细胞细胞外陷阱,NET。
添加细胞不可渗透的 DNA 染料,仅与 NET 中的细胞外 DNA 结合。在荧光显微镜下,中性粒细胞呈红色,具有绿色细胞外网状结构,证实了 NET 的形成。
在
含有 2% FCS 的无酚红 RPMI-1640 培养基中以每毫升 420,000 个细胞的密度制备细胞悬液。将 90 微升中的 37,500 个中性粒细胞添加到黑色 96 孔平底板的每个孔中。
接下来,一式三份加入 10 微升所选刺激物,以在每个孔中达到 10% 的浓度。始终一式三份包括阴性对照。在 37 摄氏度的黑暗中孵育所需的时间,范围从 30 分钟到 2、4 或 6 小时。然后,准备所需的体积的不渗透性 DNA 染料,以添加 25 微升 5 微摩尔不渗透 DNA 染料,以在每个孔中达到 1 微摩尔的最终浓度。
在
孵育时间结束前 15 分钟,向每个孔中加入 25 微升 5 微摩尔不渗透 DNA 染料。在黑暗中在 37 摄氏度下继续孵育最后 15 分钟。之后,非常小心地取出上清液,并在需要时储存。加入 100 微升 4% 多聚甲醛。将盘子放在黑暗中,然后立即进行下一部分。
配置设置后,选择 Z 系列。选择 10 作为步数 。选择 3 微米作为步长。将板加载到免疫荧光共聚焦显微镜中。
单击"运行"选项卡。填写板名称和描述,然后选择存储位置。选择需要获取的井。选择德克萨斯红和 FitC 的曝光时间,然后单击获取板并开始采集,每个板大约需要 1 小时。
之后,选择分析宏。然后,选择 W1 并选择阈值。接下来,选择所需的像素值,最后,在第二个 ImageJ 窗口中,选择 W2 并选择具有所需像素值的阈值。选择电子表格文件的目标位置。运行分析,然后保存日志文件。