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从含有荧光标记的中性粒细胞的多孔板开始,加入含有抗中性粒细胞胞质抗体的患者血清进行处理。
这些抗体与中性粒细胞的 Fc 受体相互作用,激活信号通路,产生活性氧(ROS),并激活肽基精氨酸脱亚氨酶。
ROS 引起中性粒细胞脱颗粒,将酶——弹性蛋白酶和髓过氧化物酶释放到细胞质中。这些酶以及活化的肽基精氨酸脱亚氨酶会转位至细胞核。
弹性蛋白酶可切割组蛋白H1,髓过氧化物酶可修饰组蛋白,从而启动染色质去凝集。活化的肽基精氨酸脱亚氨酶可诱导组蛋白瓜氨酸化,将精氨酸残基转化为瓜氨酸,进一步促进去凝集过程。
解凝缩的染色质与细胞内蛋白质混合,包括抗菌蛋白和胞质蛋白。随后,中性粒细胞的细胞膜破裂,将与胞质蛋白混合的解凝缩染色质释放到细胞外空间,形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap, NET)。
加入不能穿透细胞的DNA染料,该染料特异性结合中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)中的胞外DNA。在荧光显微镜下,中性粒细胞呈红色,伴有绿色的网状胞外结构,从而证实NET的形成。
用含2% FCS的无酚红RPMI-1640培养基将细胞重悬至浓度为每毫升420,000个细胞。每孔加入90微升含37,500个中性粒细胞的悬液至黑色96孔平底板中。
接下来,将选定的刺激物以每孔10微升的体积,设置三个复孔,加入至各孔中,使终浓度达到10%。每次实验均需设置三个复孔的阴性对照。在37摄氏度避光条件下孵育,孵育时间根据需要可选择30分钟、2小时、4小时或6小时。随后,配制所需体积的不可渗透性DNA染料,以便向每孔加入25微升浓度为5微摩尔的不可渗透性DNA染料,使各孔中染料的终浓度达到1微摩尔。
在孵育时间结束前15分钟,向每个孔中加入25微升5微摩尔的不可渗透性DNA染料。在37摄氏度避光条件下继续孵育最后的15分钟。此后,小心地移除上清液,如有需要可保存。加入100微升4%多聚甲醛。保持培养板避光,并立即进入下一环节。
设置完成后,选择Z系列。将步数设置为10。将步长设置为3微米。将样品板载入免疫荧光共聚焦显微镜中。
单击 运行 选项卡。填写板名称和描述,并选择存储位置。选择需要采集的孔。为 Texas Red 和 FitC 选择 曝光时间,然后单击 采集板 并开始采集,每块板的采集时间约为 1 小时。
此后,选择 分析 宏。然后选择 W1 并设定阈值。接着选择所需的像素值,最后在第二个 ImageJ 窗口中选择 W2,并使用所需的像素值设定阈值。指定电子表格文件的保存位置。运行分析,之后保存日志文件。