一种通过乳酸脱氢酶释放检测法检测巨噬细胞中Cryptococcus neoformans感染的方法

取一块含有巨噬细胞的多孔板。

将新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）加入检测孔中，而对照孔仅含有巨噬细胞。

巨噬细胞在吞噬体中吞噬真菌。

用缓冲液洗涤以去除未被吞噬的真菌。加入不含抗生素的培养基。孵育。

吞噬体与溶酶体融合，形成吞噬溶酶体。真菌可调节吞噬溶酶体的pH值，并具备内在机制以在严苛的吞噬溶酶体环境中存活。真菌使吞噬溶酶体膜通透化并进行复制，同时胞质内积聚充满多糖的囊泡。

细胞内真菌的定植与复制可导致细胞损伤，从而激活细胞死亡通路。这会引起巨噬细胞裂解及胞内内容物释放，包括乳酸脱氢酶（LDH），进入培养基中。

在不同时间点收集含有乳酸脱氢酶（LDH）的培养基。在相近时间点裂解对照巨噬细胞，以获得最大细胞内LDH释放量。将检测试剂加入收集的培养基和裂解液中。LDH将乳酸转化为丙酮酸，同时还原NAD⁺。脱氢酶进一步还原四唑盐，生成红色的甲臜产物。

使用酶标仪测定甲臜的吸光度，以量化巨噬细胞裂解情况 新型隐球菌 感染

为进行巨噬细胞感染实验，需从对数中期培养物中收集并离心 C. neoformans 细胞，随后在相同离心条件下，用 1 毫升室温 PBS 轻柔洗涤三次。

最后一次洗涤后，将真菌细胞重新悬浮于无抗生素的细胞培养基中，浓度为每毫升 1.2 × 10⁸ 个细胞，并将 1 毫升真菌细胞悬液加入 6 孔巨噬细胞培养板中 4 个孔，每个孔内巨噬细胞融合度为 70% 至 80%。然后，将培养板放入细胞培养箱中孵育 3 小时。小心倾斜培养板，使每孔用 1 毫升 PBS 轻柔洗涤 3 次，每次洗涤每孔加入 1 毫升 PBS。

为了在最后一次洗涤后测定感染效率，向6孔板的每孔中加入1毫升不含抗生素的培养基，并将该板放入细胞培养箱中。在适当的实验时间点，收集每孔的上清液，并根据标准方案测定每孔中乳酸脱氢酶（LDH）的含量。在同一时间点，裂解未感染的巨噬细胞以测定最大细胞毒性值。

随后可使用所示公式计算细胞毒性。