在免疫缺陷小鼠中构建人类微血管网络的生物工程方法

本实验的总体目标是构建体内人源血管网络。首先培养人外周血来源的内皮集落形成细胞和人骨髓来源的间充质干细胞，然后将这两种细胞混合到胶原蛋白基质凝胶中，并皮下注射至免疫缺陷小鼠体内，从而实现这一目标。

七天后，取出植入物并评估其内人源血管网络的形成情况。最终，可通过组织学和免疫组织化学方法验证植入物内是否存在人特异性微血管。与诸如手术植入构建体等传统方法相比，该技术的主要优势在于LED，操作简单便捷，且无需进行手术。

首先，解冻一管 E CFCs，并立即用含有 10 毫升 DMEM 的 15 毫升锥形管稀释细胞。在 1200 转/分钟下离心细胞悬液 5 分钟，将细胞沉淀重悬于 10 毫升预热的 EGM-2 培养基中。随后将细胞转移至经 1% 明胶包被的 100 毫米组织培养皿中，在湿润化培养箱中过夜培养。

次日早晨，轻柔地吸出培养基及未结合的细胞。然后用 10 毫升新鲜的 E GM 2 培养基喂养已结合的细胞。在接下来的几天内继续此操作，直至形成融合的单层细胞。

然后用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。弃去 PBS，加入 2 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液，将培养板放回培养箱中孵育 5 分钟。5 分钟后，在显微镜下轻轻拍打培养板，观察细胞是否已脱落。

如果细胞未完全脱落，可重复进行短暂孵育并轻轻摇动。待细胞完全脱落后，向细胞中加入8毫升EGM-2培养基，将细胞转移至15毫升锥形离心管中。计数细胞，并在1200转/分钟下离心5分钟。

现在将细胞接种于涂有1%明胶的组织培养板上，接种密度为每平方厘米5,000个细胞。在EGM-2培养基中培养细胞，并每两至三天用EGM-2培养基换液一次。在第4至第8代传代过程中重复此操作。

E CFCs 将可直接使用。该方案也可用于培养 MSCs，只需将 E GM 2 培养基替换为 M-S-C-G-M 培养基即可。

使用未包被的培养皿。在细胞融合度达到80%时开始传代，接种密度为每平方厘米10,000个细胞。本实验每个植入物需要800,000个E CFCs和1,200,000个MSCs。

通常同时准备五个植入物。首先从培养板中吸除细胞培养基，然后用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每块细胞培养板。弃去PBS，加入2毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，并将培养板置于轻柔摇动条件下孵育。

每隔两到五分钟在显微镜下观察细胞，直至所有细胞脱落。然后加入 8 毫升 DMEM 培养基，收集细胞悬液。在 15 毫升离心管中对细胞进行计数，并将足够进行五次移植的细胞转移至另一个 15 毫升离心管中。

然后以1200 RPM离心5分钟，沉淀细胞并移除上清液。在冰上小心配制纤维蛋白原与胶原纤连蛋白的混合液。随后将细胞沉淀非常轻柔地重悬于预冷的混合液中。

避免产生气泡，将细胞悬液加入一个1毫升注射器中，并连接一个带帽的26号针头。将装有细胞悬液的注射器置于冰上，直至进行细胞混合物注射。使用异氟烷麻醉舱对四只六周大的无胸腺裸鼠免疫缺陷小鼠进行麻醉。

待小鼠麻醉且对脚趾夹捏无反应后，开始对每只小鼠进行注射。使用30号针头在背部上方区域皮下注射50 µL凝血酶溶液。在同一位置，注射200 µL细胞混合物。

使用26号针头注射时，大分子物质会凝胶化并在皮下形成一个微小但明显的隆起。注射后，将小鼠置于纱布层上以保持舒适和温暖。观察小鼠直至其恢复自主活动。

接下来的三天内，每天观察动物的一般健康状况。注射后一周，使用二氧化碳处死小鼠，并通过手术取出凝胶栓。取出后，将凝胶栓与尺子一同拍照，然后将每个凝胶栓放入组织学包埋盒中，置于10%中性缓冲福尔马林中，室温下固定过夜。

第二天，用蒸馏水洗去10%中性缓冲甲醛。将包埋盒置于4°C的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存，直至进行组织学评估。对石蜡包埋的植入物制备7微米厚的切片。

然后定量分析植入物中部区域的微血管密度。借助苏木精和伊红（H&E）染色，计数每平方毫米内的血管数量，以证实微血管的人源性。使用市售的抗人CD31抗体对切片进行染色，抗体稀释比例为1:100。

此相差图像显示了脐带血来源的内皮集落形成细胞（eCFCs）在典型融合单层中内皮细胞的特征性鹅卵石样形态。该图像展示了人骨髓来源间充质干细胞（MSCs）典型的纺锤形形态。在小鼠宿主体内孵育一周后，以黄色虚线标记的植入物在更高放大倍数下与宿主组织呈现出明显不同的外观。

多个微血管显示出其管腔结构内含有红细胞，并以黄色箭头标示。对栓塞物进行免疫组化检测时，微血管管腔对人源CD31单克隆抗体呈阳性反应。细胞核经伊红复染。

一旦掌握，只要操作得当，该技术可在一盎司内完成。