生物人类免疫缺陷小鼠的微血管网络
July 11th, 2011
在这里，我们描述了一种方法来提供人脐血源性内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）和骨髓来源的间质干细胞（MSCS），胶原蛋白/纤维连接蛋白凝胶中嵌入皮下到免疫缺陷小鼠，。这种细胞/凝胶相结合，产生一个人的血管网，用鼠标血管连接。
该程序的总体目标是生成体内人类血管网络。这是通过首先培养人血液来源的内皮集落形成细胞和人骨髓来源的间充质干细胞来实现的。然后将两种细胞类型混合到基于胶原蛋白的凝胶中，将其皮下注射到免疫缺陷小鼠中。
7 天后，收获植入物并评估人类血管网络的形成。最终，可以通过他的组织学和免疫组织化学来验证植入物内是否存在人类特异性微血管。与外科植入结构体等酸性方法相比，该技术的主要优点是 LED，简单易行，并且不需要手术。
首先解冻一小瓶 E CFC，然后立即在含有 10 mL DMEM 的 15 mL 锥形瓶中稀释细胞。以 1200 RPM 的速度离心细胞悬液 5 分钟，然后 Resus 将细胞沉淀悬浮在 10 mL 温热的 EGM 2 培养基中。然后将细胞转移到涂有 1% 明胶的 100 毫米组织培养板中，并在加湿培养箱中孵育细胞过夜。
第二天早上，轻轻吸出培养基和任何未结合的细胞。然后用 10 毫升新鲜的 E GM 两种培养基喂养结合的细胞。在接下来的几天里继续这个过程，直到形成汇合的单层。
然后用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。用 2 毫升 tripsin EDTA 替换 PBS，并将板放回培养箱中 5 分钟。在显微镜下 5 分钟后，轻轻敲击板并检查细胞是否脱落。
如果没有，请轻轻摇晃重复短暂的孵育。细胞完全分离后，向细胞中加入 8 mL EGM 2 培养基，并将细胞转移至 15 mL 锥形瓶中。对细胞进行计数，并以 1200 RPM 的速度离心 5 分钟。
现在将细胞接种在涂有 1% 明胶的组织培养板上，座位密度为每平方厘米 5， 000 个细胞。在 EGM 2 培养基中，孵育细胞，每 2 到 3 天用 EGM 2 培养基补料一次。对第 4 次和第 8 次次之间的后续次级重复此过程。
E CFC 将可供使用。该协议也可用于培养 MSC。只需将 E GM 二培养基替换为 M-S-C-G-M 培养基即可。
使用未包被的培养板。在 80% 汇合度处开始传代培养，并以每平方厘米 10， 000 个细胞的接种密度进行传代培养。该实验需要每个植入物 800， 000 个 E CFC 和 1， 200， 000 个 MSC。
通常同时准备五个种植体。首先从培养板中吸出细胞培养基，并用 10 毫升 PBS 洗涤每板细胞。用 2 毫升胰蛋白酶 EDTA 替换 PBS，并轻轻摇动孵育板。
每 2 到 5 分钟在显微镜下检查一次细胞，直到细胞全部脱离。然后加入 8 毫升 DMEM 并收集细胞溶液。在 15 毫升锥形瓶中，对细胞进行计数，并将足够用于 5 个植入物的细胞转移到一个 15 毫升锥形瓶中。
然后以 1200 RPM 的速度离心细胞 5 分钟并取出 snat。在冰上小心地准备纤维蛋白原和胶原纤连蛋白的混合物。然后非常轻柔地将细胞沉淀重悬于冰冷的混合物中。
为避免形成气泡，将细胞悬液装入 1 毫升注射器中，并连接带盖的 26 号针头。将加载的注射器放在冰上，直到注射细胞混合物。使用 ISO 氟室麻醉四只 6 周龄的无胸腺裸核免疫缺陷小鼠。
一旦小鼠被麻醉并且对脚趾捏没有反应，就继续为每只小鼠注射。使用 30 号针头将 50 微升凝血酶溶液皮下注射到上背侧区域。在同一位置，注入 200 μL 细胞混合物。
使用 26 号针头，注射的大分子会凝胶化并在皮肤下形成一个小但明显的肿块。注射后，将小鼠放在一层纱布上以获得舒适和温暖。观察他们，直到他们可以走动。
在接下来的三天里，每天观察动物的总体健康状况。注射后一周，用二氧化碳对小鼠实施安乐死，并通过手术去除凝胶塞。取出后，用尺子拍摄凝胶塞，然后将每个凝胶塞放入组织学盒中，并在室温下将它们浸入 10% 中性缓冲福尔辛中过夜。
第二天，用蒸馏水洗去 10% 中性缓冲福尔明。将盒储存在 4 摄氏度的 PBS 中，直到对其进行组织学评估。将植入物的 7 微米切片嵌入石蜡中。
然后量化植入物中间部分微血管的密度。在 H 和 e 染色评分下，每平方毫米的血管数量，以证明微血管的人性。用市售的抗人 CD 31 抗体以 1 比 100 的稀释度对切片进行染色。
该相差图像显示了脐带血来源的 e CFC 的典型汇合单层中内皮细胞的特征性鹅卵石形态。该图显示了人骨髓来源的 MSC 的典型纺锤形形态。在小鼠宿主中孵育一周后，在较高放大倍率下，由黄色虚线标记的植入物看起来与宿主的组织非常不同。
揭示了多个微血管，其包含红细胞的管腔结构，并由黄色箭头突出显示。当免疫组织化学检查栓子时，微血管的管腔与人 CD 31 的单克隆抗体反应。细胞核用血红素复染。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一盎司内完成。
概述
本文描述了一种方法，将人脐带血源性内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）和骨髓源性间充质干细胞（MSCs）嵌入胶原/纤维连接蛋白凝胶中，并注射到免疫缺陷小鼠体内。该方法旨在生成与小鼠血管系统整合的人类血管网络。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 再生医学
- 血管生物学
背景
- 内皮细胞集落形成细胞（ECFCs）对血管再生至关重要。
- 间充质干细胞（MSCs）在组织工程中具有潜力。
- 将这些细胞类型组合在凝胶基质中可增强血管网络的形成。
- 免疫缺陷小鼠作为研究人类细胞整合的模型。
研究目的
- 开发一种在体内创建人类血管网络的非手术方法。
- 评估ECFCs和MSCs形成微血管的效率。
- 评估人类细胞与小鼠血管系统的整合情况。
使用的方法
- 在特定培养基中培养和制备ECFCs和MSCs。
- 将细胞嵌入胶原/纤维连接蛋白凝胶中以便注射。
- 注射到麻醉的免疫缺陷小鼠皮下。
- 通过组织学分析评估植入后微血管的形成。
主要结果
- 在植入物中成功形成人类特有的微血管。
- 组织学检查确认了人类内皮细胞的存在。
- 该方法被证明比手术植入更简单有效。
- 量化了微血管密度，证明了该方法的有效性。
结论
- 所描述的方法是血管组织工程的一种可行的替代方案。
- 它允许在活体中研究人类细胞行为。
- 该技术可能推进再生医学应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Establishing functional human vascular networks in vivo remains a critical challenge for tissue engineering and regenerative medicine, particularly for preclinical validation of vascularized constructs. This model enables direct assessment of human endothelial behavior and network integration within a living system, supporting mechanistic de-risking of vascular therapies. By demonstrating anastomosis with host circulation, it provides predictive confidence for translational advancement of cell-based vascularization strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of human endothelial colony-forming cell functionality in vascular network formation.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo assay to validate pro-angiogenic targets using human-derived cells.
- Scientific Value: Supports de-risking of vascular targets by confirming lumen formation and host vessel anastomosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable microvessel density readouts for compound or condition screening.
- Operational Value: Standardizes vascular network formation via defined cell ratios and gel matrix for assay consistency.
- Scientific Value: Enables evaluation of human-specific vascular integration independent of species mismatch.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human vascular engraftment and stability for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of network maturation and perfusion in vivo.
- Scientific Value: Informs risk-adjusted decisions on vascularized tissue constructs prior to IND-enabling studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling early validation of vascular competence before lead optimization and preclinical safety studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on human angiogenic pathways and perivascular cell crosstalk.
- Screening: Delivers standardized, quantitative vascular network formation as a phenotypic readout.
- Analytics: Provides histological and immunohistochemical outputs to quantify human microvessel density and perfusion.
- Translational Research: Bridges in vitro angiogenesis assays to in vivo functional validation using human cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for evaluating multiple cell types, scaffolds, or therapeutics in a common vascularization assay.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vascular target validation through functional human network formation.
- Operational Value: Offers a simple, surgery-free implantation method enhancing reproducibility across sites.
- Strategic Value: Reduces late-stage vascular failure risk by confirming host integration early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions on vascularized regenerative candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell culture and sterile surgical techniques.
- Depends on access to immunodeficient mouse models and histological imaging infrastructure.
- Necessitates standardized cell preparation and gel mixing to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves optimization of cell ratios and matrix composition for different vascularization goals.
- Limited by the 7-day window for network assessment, requiring timely endpoint analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Culture of Human Cord Blood-derived Endothelial Colony-forming Cells (ECFCs) and Bone-marrow Derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)
2:51
Resuspension of Cells in Collagen/Fibronectin/Fibrinogen Solution (Day 0)
4:05
Injection into Immunodeficient Nude Mouse (Day 0)
4:51
Harvesting the Implants (Day 7) and Evaluation
5:50
Cell Morphology
6:38
Conclusion
