Name: 生物人类免疫缺陷小鼠的微血管网络 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解利用人脐带血内皮集落形成细胞与骨髓间充质干细胞在胶原/纤连蛋白凝胶中构建人源微血管网络的方法。该技术通过皮下注射至免疫缺陷小鼠体内，实现人源血管与宿主血管整合，为再生医学研究提供简单有效的血管组织工程模型。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 K99EB009096-01A1 支持，项目负责人：J.M.-M.

1. 准备
<ol>
	<li>配制 EGM-2 培养基（500 mL）
	<ul>
		<li>将 100 mL 胎牛血清（FBS）加入 395 mL 内皮细胞基础培养基（EBM-2）中。</li>
		<li>加入 5 mL 100 倍谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液（GPS）。</li>
		<li>加入 EGM-2 SingleQuots 补充剂中的所有成分，但氢化可的松除外（即 VEGF、hFGF-B、R-IGF-1、hEGF、肝素、抗坏血酸和 GA-1000）。</li>
		<li>使用孔径为 0.2-μm 的真空滤器过滤除菌。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>配制 MSCGM 培养基（500 mL）
	<ul>
		<li>将 5 mL 100 倍 GPS 溶液加入 440 mL 间充质干细胞基础培养基（MSCBM）中。</li>
		<li>加入 MSCGM SingleQuots 试剂盒中的全部内容物。</li>
		<li>加入来自 EGM-2 SingleQuots 补充剂的 hFGF-B 分装液。</li>
		<li>使用孔径为 0.2-μm 的真空滤器过滤除菌。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>配制 DMEM 培养基（500 mL）
	<ul>
		<li>将 50 mL 胎牛血清（FBS）加入 440 mL 1 倍高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中。</li>
		<li>加入 5 mL 100 倍 GPS 溶液。</li>
		<li>加入 5 mL 非必需氨基酸溶液。</li>
		<li>使用孔径为 0.2-μm 的真空滤器过滤除菌。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>配制胶原蛋白/纤连蛋白溶液（3.6 mL；注射当天配制）
	<ul>
		<li>将 0.4 mL 10 倍 DMEM 加入 150 μL 蒸馏 H2O 中。</li>
		<li>加入 100 μL 1 M HEPES 溶液（终浓度 25 mM）。</li>
		<li>小心加入 2.4 mL 牛胶原蛋白（储存液浓度为 5 mg/mL，终浓度为 3 mg/mL），并在冰上轻轻混匀。</li>
		<li>通过加入 1 N NaOH 溶液（约 30 μL）调节 pH 至中性。</li>
		<li>使用酚红指示剂判断中性 pH；也可使用 pH 试纸监测 pH。</li>
		<li>加入 120 μL 人纤连蛋白（储存液浓度为 1 mg/mL，终浓度为 30 μg/mL）。</li>
		<li>加入 0.4 mL FBS（终浓度为 10%）。</li>
		<li>使用前将溶液置于冰上保存。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>配制纤维蛋白原溶液（1 mL；注射当天配制）
	<ul>
		<li>将 30 mg 粉末状纤维蛋白原加入 1 mL 0.9 N NaCl 溶液（pH 7.4）中（终浓度为 30 mg/mL）。</li>
		<li>使用前在 37°C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>加入胶原蛋白/纤连蛋白凝胶前，轻轻混匀，避免涡旋震荡。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>配制凝血酶溶液（200 mL）
	<ul>
		<li>将 1 KU 粉末状凝血酶加入 200 mL 0.9% NaCl 生理盐水中（终浓度为 50 U/mL）。</li>
		<li>使用孔径为 0.2-μm 的注射器滤器过滤除菌，并于 -20°C 保存至使用。</li>
		<li>使用前用 0.9% NaCl 生理盐水稀释至终浓度为 10 U/mL。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>配制 1% 明胶溶液（500 mL）
	<ul>
		<li>将 5 g 粉末状明胶加入 500 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>在 121°C 下高压灭菌 30 分钟。</li>
		<li>使用孔径为 0.2-μm 的真空滤器过滤除菌。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>使用 1% 明胶包被液 对 100-mm 组织培养皿进行 包被
	<ul>
		<li>向每个 100-mm 组织培养皿中加入 10 mL 1% 明胶溶液。</li>
		<li>在 37°C 下孵育 60 分钟。</li>
		<li>使用前吸除明胶溶液，并用 PBS 洗涤一次。</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
2. 人脐带血来源内皮集落形成细胞（ECFCs）的培养
本实验方案假设实验室中已备有冻存的内皮集落形成细胞（ECFC）冻存管。ECFC可从脐带血或成人外周血的单个核细胞组分中分离获得，分离方法如前所述7。
<ol>
	<li>从液氮罐中取出一支内含内皮集落形成细胞（ECFCs）的冻存管（通常为1 mL冻存液中含0.5–1×106个细胞），立即将其内容物加入含有10 mL DMEM培养基的15 mL锥形管中稀释。以1200 rpm离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL预温的EGM-2培养基中。</li>
	<li>将10 mL ECFC悬液加入一个经1%明胶包被的100 mm组织培养皿中。将培养皿置于37°C、含5%CO2的加湿培养箱中孵育。次日，轻柔吸除未贴壁的细胞及培养基，并用10 mL新鲜EGM-2培养基对已贴壁细胞进行换液。</li>
	<li>每隔2–3天用EGM-2培养基对培养皿进行换液。让细胞持续增殖，直至形成融合的单层细胞。当细胞达到融合状态时，按以下步骤进行传代：</li>
	<li>吸除培养基，用10 mL PBS洗涤细胞。</li>
	<li>移除PBS，向每个100 mm培养皿中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻摇晃培养皿使胰蛋白酶-EDTA溶液均匀分布。在37°C、含5%CO2条件下孵育3–5分钟。轻敲培养皿，在倒置显微镜下观察细胞是否已从皿底脱落并悬浮。</li>
	<li>当细胞完全脱落时，加入8 mL EGM-2培养基，将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。取10 μL细胞悬液，用血细胞计数板计数，并计算收获的总细胞数。</li>
	<li>使用EGM-2培养基，将细胞以5,000个细胞/cm2的接种密度接种于经1%明胶包被的组织培养皿中。将培养皿放入培养箱中，并每隔2–3天用EGM-2培养基换液一次。</li>
</ol>
对后续传代重复此操作。在扩增细胞群体时，记录传代次数。内皮集落形成细胞（ECFCs）将在第4至8代之间使用。
3. 人骨髓来源间充质干细胞（MSCs）的培养
本方案假设在开展本实验前，实验室已备有人类间充质干细胞（MSC）的冻存管。MSC可从骨髓抽吸物中分离获得，方法如前所述11。
<ol>
	<li>解冻一管MSCs（通常为0.50–1×106 从液氮储存罐中取出1 mL冻存液中的细胞，立即加入含有10 mL DMEM培养基的15 mL圆锥形离心管中并混匀。以1200 rpm离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL预温的MSCGM培养基中。</li>
	<li>将10 mL MSC悬液加入一个未包被的100 mm组织培养皿中。将培养皿置于湿润的培养箱内，于 37°C 和5%CO₂2次日，轻柔吸出未结合的细胞和培养基，并用 10 mL 新鲜 MSCGM 培养基滋养已结合的细胞。</li>
	<li>每2-3天用MSCGM培养基换液一次。待细胞增殖至培养皿中细胞单层达到80%汇合度时，按以下步骤进行传代培养：</li>
	<li>吸出培养基，用 10 mL PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>吸除 PBS，向每个 100-mm 培养皿中加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。轻轻晃动培养皿，使胰蛋白酶-EDTA 溶液均匀分布。置于 37 °C 培养箱中孵育 37°C 并在5% CO₂条件下孵育3-5分钟。轻轻敲击培养板，于倒置显微镜下观察悬浮的脱落细胞。</li>
	<li>当细胞完全脱落时，加入8 mL MSCGM培养基，并将细胞悬液收集至15 mL锥形离心管中。取 10 μL 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算收获的细胞总数。</li>
	<li>将细胞以每平方厘米10,000个细胞的接种密度接种于未包被的组织培养板中2 使用MSCGM培养基。将培养板置于培养箱中，并每隔2-3天用MSCGM培养基换液。</li>
</ol>
对后续传代重复此操作。在扩增细胞群体时，需记录传代次数。间充质干细胞将在第4至第8代之间使用。
4. 在胶原蛋白/纤连蛋白/纤维蛋白原溶液中重悬细胞（第0天）
实验前，确保培养物中有足够数量的内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）；每次植入和每只小鼠需要 0.8×106 个 ECFCs 和 1.2×106 个 MSCs。
<ol>
	<li>吸弃每个培养皿中的培养基，用 10 mL PBS 洗涤细胞。去除 PBS 后，向每个 100 mm 培养皿中加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。轻轻摇晃培养皿，使胰蛋白酶-EDTA 溶液均匀分布。在 37 °C 下孵育 3–5 分钟。轻敲培养皿，在倒置显微镜下观察悬浮的脱落细胞。</li>
	<li>当细胞完全脱落时，加入 8 mL DMEM 培养基，将细胞悬液收集至 15 mL 圆锥形离心管中。取 10 μL 样品，用血细胞计数板计数细胞，并计算收获的 ECFCs 和 MSCs 的总数。</li>
	<li>将 4×106 个 ECFCs（5 份，每份 0.8×106 个细胞）和 6×106 个 MPCs（5 份，每份 1.2×106 个细胞）共同转移至一个 50 mL 圆锥形离心管中。此为制备五个独立植入物及用于五只小鼠所需的总细胞量。以 1200 rpm 离心，弃去上清液。</li>
	<li>轻轻将 100 μL 纤维蛋白原溶液加入 0.9 mL 胶原蛋白/纤连蛋白溶液中（终浓度为 3 mg/mL 纤维蛋白原）；将混合物置于冰上保存。</li>
	<li>用 1 mL 冰冷的胶原蛋白/纤连蛋白/纤维蛋白原溶液重悬细胞沉淀；轻柔混匀细胞，避免产生气泡。将混合液吸入一支 1 mL 无菌注射器中，并在注射器前端安装带帽的 26 号针头。将装有混合物的注射器置于冰上，直至进行注射。</li>
</ol>
5. 免疫缺陷裸鼠注射（第0天）
所有动物实验将使用6周龄的裸鼠（athymic nude，nu/nu）进行。
<ol>
	<li>注射前，将免疫缺陷小鼠放入输送异氟烷的气体麻醉室中进行麻醉。让小鼠吸入异氟烷约2分钟，直至其麻醉且对脚趾夹捏无反应（通过观察监测其心跳）。</li>
	<li>对每只小鼠，使用26号针头在背部上部区域皮下注射50 μL凝血酶溶液（10 U/mL）。</li>
	<li>在注射凝血酶的同一位置，使用26号针头注射200 μL细胞混合物。胶原蛋白在37°C下会凝胶化，而纤维蛋白原在凝血酶存在下会形成纤维蛋白凝胶。因此，植入物应在皮下形成一个虽小但可触及的隆起。</li>
	<li>注射后，将小鼠置于纱布层上以保持舒适和保暖，并观察直至其恢复自主活动。随后，在最初三天内每天观察小鼠一次。</li>
</ol>
6. 收获（第7天）
<ol>
	<li>注射后一周，将小鼠放入输送压缩 CO2 气体的气体安乐死舱中实施安乐死。</li>
	<li>安乐死后，在注射部位附近切开皮肤，手术取出凝胶塞。建议对取出的凝胶塞进行带标尺的数码拍照。</li>
	<li>将收获的凝胶塞放入组织学包埋盒中，并在室温下浸入 10% 中性缓冲甲醛溶液中固定过夜。</li>
	<li>固定完成后，用蒸馏 H2O 洗去 10% 中性缓冲甲醛溶液，随后将组织学包埋盒置于 4°C 的磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至进行组织学评估。</li>
</ol>
7. 评估：组织学（H&amp;E）与免疫组织化学（hCD31）
<ol>
	<li>进行组织学评估时，将植入物包埋于石蜡中，并按照标准组织学程序切片（切片厚度为 7 μm）。</li>
	<li>通过分析取自植入物中部的苏木精-伊红（H&amp;E）染色切片来定量微血管密度。H&amp;E 染色的标准操作流程可参考其他文献。微血管可被识别为含有红细胞的管腔结构。微血管密度以所分析视野中含红细胞的微血管平均数量表示，单位为血管数/mm2。</li>
	<li>为证实微血管的人源性，应对回收的植入物切片采用人特异性 CD31（hCD31）抗体进行免疫组织化学染色，染色步骤遵循标准方案。我们推荐使用 DakoCytomation 公司的单克隆小鼠抗人 CD31 抗体（克隆号 JC70A；货号 # M0823），稀释比例为 1:100。该抗体的人特异性已通过多种小鼠组织切片的平行染色结果得到验证，后者均呈阴性反应7,11。需要注意的是，小鼠自身的血管常出现在植入物内部（尤其在边缘区域），但这些小鼠血管不会被该抗体染色。此外，可通过使用针对 CD90 或 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的人特异性抗体进行免疫组织化学染色，以检测人源间充质干细胞（MSC）的存在。人源 MSC 可分布于新生血管的血管周围区域，也可散在分布于植入物的间质区域11。</li>
</ol>
8. 典型结果
<img alt="ECFC 和 MSC 培养显微图像、细胞形态比较，200µm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. ECFC 和 MSC 培养物的典型形态。相差显微图像显示了体外培养条件下 ECFC 和 MSC 的典型外观。（A）来自脐带血的 ECFC 形成融合单层，呈现内皮细胞特征性的鹅卵石样形态。（B）人骨髓来源的 MSC 呈梭形形态。比例尺：200 µm。
<img alt="肿瘤组织提取；显微镜图像突出显示肿瘤大小和特征。" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 第7天取出的组织块外观。如文中所述，将人脐带血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）和骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）包埋于胶原蛋白/纤连蛋白/纤维蛋白凝胶中，并皮下植入裸鼠体内。（A）7天后，在处死小鼠后，剪开注射部位附近的皮肤，翻起皮肤以暴露细胞/凝胶组织块。（B）手术取出后、经甲醛固定前的组织块外观。植入物呈红色表明已发生血管化。
<img alt="组织病理学：显微镜下观察染色的组织切片，显示细胞结构和炎症。" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 移植后组织块中血管网络的组织学鉴定。取自移植后组织块中部的苏木精和伊红（H&amp;E）染色切片。（A）低倍镜（10×）图像，显示植入物（以黄色虚线标出）及其周围宿主组织（即脂肪组织和骨骼肌）的整体结构。（B）高倍镜（40×）图像，显示组织块内多个微血管（黄色箭头指向其中部分微血管）；微血管可被识别为含有红细胞的管腔样结构。
<img alt="组织学切片、细胞分析、染色组织、显微镜结果，显示细胞结构。" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 人源性管腔的免疫组织化学鉴定。 取自移植栓塞物中段的免疫组织化学染色切片。染色使用 DakoCytomation 公司生产的单克隆小鼠抗人 CD31（hCD31）抗体（克隆号 JC70A；货号 # M0823），稀释比例为 1:100；细胞核经苏木精复染。（A）低倍镜（10×）图像，显示植入物（以黑色虚线标示）及其周围宿主组织的整体情况。人特异性 CD31 阳性微血管呈棕色（过氧化物酶染色）。（B）高倍镜（40×）图像，显示栓塞物内存在多个人源性微血管（黑色箭头指示部分 hCD31 阳性管腔）。

<ol><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li>
<li>Koike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+creation+of+long-lasting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels.</a> Nature. 428, 138-139 (2004).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+complex+microvessels+lined+by+human+endothelial+cells+in+an+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).</li>
<li>N&ouml, r, E, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+functional+human+microvessels+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice.</a> Lab Invest. 81, 453-463 (2001).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-1305 (2008).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Traktuev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Functional+Vascular+Network+Formation+In+Vivo+by+Cooperation+of+Adipose+Progenitor+and+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells.</a> Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Myeloid+Cells+Are+Necessary+for+Creating+Bioengineered+Human+Vascular+Networks+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

这是一种生物工程化人源血管网络的实验模型。该模型的主要特征包括：1）微血管由来自出生后组织（即血液和骨髓）的人源细胞形成；2）微血管在成年动物体内形成；3）微血管并非来源于已存在的（宿主）血管，而是由悬浮在适宜凝胶中的单个细胞从头（de novo）形成。
血管生成在该实验中起着重要作用，因为需要与小鼠的脉管系统建立连接，以形成充满红细胞的血管，这是本实验的功能性检测指标之一。此外，移植后的早期阶段会募集宿主的髓系细胞至植入物中，这些细胞对于新生血管床的形成是必需的 12。
该实验模型提供了一个多功能、可量化且相对简单的体系，用于在活体（in vivo）条件下研究人类血管网络的出生后形成过程。此外，该检测方法操作简便，无需进行切口或外科手术。该模型可用于评估不同来源的人内皮细胞和血管周围细胞的血管发生潜能。该模型还可用于筛选具有抗血管发生和/或促血管发生活性的化合物。最后，该模型可用于研究特定基因在由人内皮构成的血管网络形成与功能中的作用。

<table><tbody><tr><td>内皮细胞基础培养基 EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuot 添加剂</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液，100 倍浓缩 GPS</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>间充质干细胞生长培养基 BulletKit，MSCBM/MSCGM</td><td>Lonza Inc.</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>高糖 Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基，1 倍 DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液，100 倍浓缩 NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>高糖 Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基，粉末状 DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 牛 I 型胶原蛋白溶液</td><td>Trevigen Inc.</td><td>3442-050-01</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 人纤维连接蛋白</td><td>Trevigen Inc.</td><td>3420-001-01</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源纤维蛋白原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0143-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液，PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液，1 倍</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，吸入用液体</td><td>Buxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 10019-360-40</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648-1KU</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗人 CD31 抗体</td><td>Dako</td><td>M0823</td><td>克隆号 JC70A</td></tr></tbody></table>

在免疫缺陷小鼠中构建人类微血管网络的生物工程方法

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

组织工程和基于细胞的组织再生治疗的未来，很可能取决于我们在体内生成功能性血管网络的能力。在这方面，寻找用于在体内构建血管网络的实验模型显得尤为重要1。体内生物工程微血管网络的可行性最早是通过使用来源于人体组织的成熟内皮细胞（ECs）得以证实的2-4；然而，这类自体来源的内皮细胞在广泛临床应用中存在困难，因其难以获取足够数量，且需从现有血管系统中进行采集。这些局限性促使人们开始探索其他EC来源。血液中内皮集落形成细胞（ECFCs）的发现，为无创获取内皮细胞提供了可能5-7。我们及其他研究者已证实，成人及脐带血来源的ECFCs具有在体内形成功能性血管网络的能力in vivo7-11。重要的是，这些研究还表明，为了获得稳定且持久的血管网络，ECFCs必须与血管周围细胞共同移植。本文所描述的实验方法正是说明了这一原理：我们展示了如何将人脐带血来源的ECFCs与骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）混合为单细胞悬液，并将其包埋于胶原蛋白/纤连蛋白/纤维蛋白原凝胶中，植入免疫缺陷小鼠体内后可在7天内形成功能性人源血管网络。在植入物中可观察到由人ECFC衬覆的管腔结构，其中含有宿主红细胞，这不仅表明了血管网络的从头（de novo）生成，也证明了其与宿主循环系统之间功能性吻合的建立。这种生物工程化人源血管网络的小鼠模型，非常适用于研究人血管网络形成的细胞与分子机制，以及开发工程化组织血管化的策略。

本文介绍一种将人脐带血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）和骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）包埋于胶原蛋白/纤连蛋白凝胶中，皮下植入免疫缺陷小鼠的方法。该细胞与凝胶的组合可形成功能性人源血管网络，并与小鼠的脉管系统相连接。

组织工程和基于细胞的组织再生疗法的未来，很可能取决于我们生成功能性血管网络的能力……

本实验的总体目标是构建体内人源血管网络。首先培养人外周血来源的内皮集落形成细胞和人骨髓来源的间充质干细胞，然后将这两种细胞混合到胶原蛋白基质凝胶中，并皮下注射至免疫缺陷小鼠体内，从而实现这一目标。七天后，取出植入物并评估其内人源血管网络的形成情况。最终，可通过组织学和免疫组织化学方法验证植入物内是否存在人特异性微血管。与诸如手术植入构建体等传统方法相比，该技术的主要优势在于LED，操作简单便捷，且无需进行手术。首先，解冻一管 E CFCs，并立即用含有 10 毫升 DMEM 的 15 毫升锥形管稀释细胞。在 1200 转/分钟下离心细胞悬液 5 分钟，将细胞沉淀重悬于 10 毫升预热的 EGM-2 培养基中。随后将细胞转移至经 1% 明胶包被的 100 毫米组织培养皿中，在湿润化培养箱中过夜培养。次日早晨，轻柔地吸出培养基及未结合的细胞。然后用 10 毫升新鲜的 E GM 2 培养基喂养已结合的细胞。在接下来的几天内继续此操作，直至形成融合的单层细胞。然后用 10 毫升 PBS 洗涤细胞。弃去 PBS，加入 2 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液，将培养板放回培养箱中孵育 5 分钟。5 分钟后，在显微镜下轻轻拍打培养板，观察细胞是否已脱落。如果细胞未完全脱落，可重复进行短暂孵育并轻轻摇动。待细胞完全脱落后，向细胞中加入8毫升EGM-2培养基，将细胞转移至15毫升锥形离心管中。计数细胞，并在1200转/分钟下离心5分钟。现在将细胞接种于涂有1%明胶的组织培养板上，接种密度为每平方厘米5,000个细胞。在EGM-2培养基中培养细胞，并每两至三天用EGM-2培养基换液一次。在第4至第8代传代过程中重复此操作。E CFCs 将可直接使用。该方案也可用于培养 MSCs，只需将 E GM 2 培养基替换为 M-S-C-G-M 培养基即可。使用未包被的培养皿。在细胞融合度达到80%时开始传代，接种密度为每平方厘米10,000个细胞。本实验每个植入物需要800,000个E CFCs和1,200,000个MSCs。通常同时准备五个植入物。首先从培养板中吸除细胞培养基，然后用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每块细胞培养板。弃去PBS，加入2毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，并将培养板置于轻柔摇动条件下孵育。每隔两到五分钟在显微镜下观察细胞，直至所有细胞脱落。然后加入 8 毫升 DMEM 培养基，收集细胞悬液。在 15 毫升离心管中对细胞进行计数，并将足够进行五次移植的细胞转移至另一个 15 毫升离心管中。然后以1200 RPM离心5分钟，沉淀细胞并移除上清液。在冰上小心配制纤维蛋白原与胶原纤连蛋白的混合液。随后将细胞沉淀非常轻柔地重悬于预冷的混合液中。避免产生气泡，将细胞悬液加入一个1毫升注射器中，并连接一个带帽的26号针头。将装有细胞悬液的注射器置于冰上，直至进行细胞混合物注射。使用异氟烷麻醉舱对四只六周大的无胸腺裸鼠免疫缺陷小鼠进行麻醉。待小鼠麻醉且对脚趾夹捏无反应后，开始对每只小鼠进行注射。使用30号针头在背部上方区域皮下注射50 µL凝血酶溶液。在同一位置，注射200 µL细胞混合物。使用26号针头注射时，大分子物质会凝胶化并在皮下形成一个微小但明显的隆起。注射后，将小鼠置于纱布层上以保持舒适和温暖。观察小鼠直至其恢复自主活动。接下来的三天内，每天观察动物的一般健康状况。注射后一周，使用二氧化碳处死小鼠，并通过手术取出凝胶栓。取出后，将凝胶栓与尺子一同拍照，然后将每个凝胶栓放入组织学包埋盒中，置于10%中性缓冲福尔马林中，室温下固定过夜。第二天，用蒸馏水洗去10%中性缓冲甲醛。将包埋盒置于4°C的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存，直至进行组织学评估。对石蜡包埋的植入物制备7微米厚的切片。然后定量分析植入物中部区域的微血管密度。借助苏木精和伊红（H&E）染色，计数每平方毫米内的血管数量，以证实微血管的人源性。使用市售的抗人CD31抗体对切片进行染色，抗体稀释比例为1:100。此相差图像显示了脐带血来源的内皮集落形成细胞（eCFCs）在典型融合单层中内皮细胞的特征性鹅卵石样形态。该图像展示了人骨髓来源间充质干细胞（MSCs）典型的纺锤形形态。在小鼠宿主体内孵育一周后，以黄色虚线标记的植入物在更高放大倍数下与宿主组织呈现出明显不同的外观。多个微血管显示出其管腔结构内含有红细胞，并以黄色箭头标示。对栓塞物进行免疫组化检测时，微血管管腔对人源CD31单克隆抗体呈阳性反应。细胞核经伊红复染。一旦掌握，只要操作得当，该技术可在一盎司内完成。

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