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取一个由可渗透膜插件分隔的双室感染系统。底部区室含有贴壁的人角质形成细胞,即皮肤细胞。
将细菌病原体加入上层腔室并进行孵育。膜可防止病原体与角质形成细胞直接接触。病原体分泌链球菌溶素S(streptolysin S)或SLS——一种小分子毒素——该毒素可穿过膜到达细胞。
角质形成细胞上的钠-碳酸氢盐共转运体介导碳酸氢根离子和钠离子的内流,维持细胞内pH值。十二烷基硫酸钠(SLS)与该共转运体结合并破坏离子转运,导致细胞内渗透压应激。
应激诱导的下游信号通路导致与被隔离的核因子-κB(NF-κB)结合的抑制剂发生降解,从而激活NF-κB。活化的NF-κB转位至细胞核,进而上调促炎性细胞因子的产生。
细胞因子分泌到胞外后,会结合宿主细胞上的死亡受体,引发坏死。孵育结束后,收集培养上清液以评估细菌毒素的影响。
处理前立即用1× PBS洗涤细胞。然后,向六孔板中加入2毫升新鲜培养基(含或不含药物处理),或向24孔板的每孔中加入0.5毫升培养基。接着,在超净工作台内,使用无菌镊子将无菌的0.4微米通透性膜插入件小心放入每个孔中。
在感染准备过程中,对可渗透小室进行轻柔且无菌的操作至关重要,以防止膜在此过程中受损或受到污染。
根据制造商说明书,向每个孔的上层室中加入新鲜的细胞培养基。然后,向可渗透膜插件系统的上层室中加入适量的标准化细菌培养物,并向对照孔中加入细菌培养基。
将细菌小心地加入上室,以及轻柔地将感染的细胞转移至培养箱,均至关重要,因为实验设置过程中必须确保细菌不会污染下室。
为了检测分泌的宿主蛋白,使用无菌镊子小心取出可渗透膜插入物。然后,在不扰动细胞单层的前提下,将下室中的培养基收集到1.5毫升离心管中。
将样品在14,000 RCF、4摄氏度条件下离心10分钟,以沉淀细胞碎片。随后,除去上清液,仅保留50微升,转移至新的1.5毫升离心管中,并于-20摄氏度保存,或立即使用。