0 次观看 • 4:15 分钟 • July 8th, 2025
首先，在可渗透膜系统的底部区域接种哺乳动物宿主细胞。
将Streptococcus（一种已知可分泌链球菌溶素S或SLS毒素的致病性细菌）加入膜插入物中。SLS毒素通过膜孔扩散并到达宿主细胞。
膜结合型钠-碳酸氢盐共转运蛋白可调节离子转运，维持细胞内稳态。该毒素与这些共转运蛋白结合，干扰离子转运过程，导致宿主细胞产生渗透压应激。
这会激活多个下游信号通路级联反应，包括p38 MAPK，即一种丝裂原活化蛋白激酶通路。活化的p38 MAPK对其下游靶标进行磷酸化，启动细胞对抗细菌的反应。
接下来，移除可渗透的膜插件。吸除宿主细胞上方的培养基。加入裂解缓冲液以释放细胞内容物。离心以沉淀细胞碎片。
收集含有可溶性裂解组分的上清液和含有不溶性裂解组分的沉淀。将样品保存以用于后续分析。
处理前立即用1× PBS洗涤细胞。然后，向六孔板中加入2毫升新鲜培养基（含或不含药物处理），或向24孔板的每个孔中加入0.5毫升培养基。接下来，在超净工作台内，使用无菌镊子将无菌的0.4微米通透性膜插入每个孔中。
在感染准备过程中，对可渗透插入物进行轻柔且无菌的操作至关重要，以防止膜在此过程中受损或受到污染。
根据制造商的说明，向每个孔的上层室中加入新鲜的细胞培养基。然后，向可渗透膜插件系统的上层室中加入适量的标准化细菌培养物，并向对照孔中加入细菌培养基。
将细菌小心地加入上室，以及轻柔地将感染的细胞转移至培养箱，这些步骤至关重要，因为在实验设置过程中必须确保细菌不会污染下室。
使用无菌镊子小心移除可渗透膜插件。
为了评估宿主细胞裂解物，轻轻吸除单层细胞上方的培养基，注意不要扰动宿主细胞。随后用 PBS 清洗细胞一次。轻轻吸除 PBS，并立即加入适量冰预冷的裂解缓冲液，使蛋白浓度达到例如 0.5 至 1.5 毫克/毫升。然后将样品在冰上孵育 15 分钟。
接下来，使用细胞刮刀将细胞从每个孔的培养板表面刮下，并将每孔的全部内容物转移至一个1.5毫升离心管中。然后，在4°C条件下以14,000 RCF离心20分钟。
为检测可溶性裂解液组分，将上清液转移至新离心管中，于-20 °C保存，或立即使用。为检测核组分或其他不溶性裂解液组分，保留沉淀，并于-20 °C保存，或立即使用。