利用荧光成像检测细菌对宿主细胞的黏附

取一个含易受细菌黏附的贴壁上皮细胞单层的多孔板。

加入不同数量的荧光蛋白标记的Pseudomonas aeruginosa（一种致病性细菌），以达到所需的细菌与上皮细胞比例。

离心以使细菌更接近上皮细胞，促进相互作用。

IV型菌毛是细菌表面的蛋白质纤维，通过与上皮细胞上的特异性糖脂结合，在介导细菌黏附于宿主细胞过程中发挥关键作用。

孵育结束后，用缓冲液洗涤以去除未黏附的细菌。固定细胞以保持细胞结构。

加入DAPI（一种可强烈结合富含A-T的DNA区域的荧光染料），对细胞核进行染色。用缓冲液覆盖细胞，防止细胞干燥。

使用DAPI染色细胞核，获取附着在上皮细胞上的GFP标记细菌的图像。统计单个上皮细胞上黏附的细菌数量。

每宿主细胞黏附细菌数量以剂量依赖性方式增加，可实现宿主-病原体相互作用的定量分析。

进行细菌黏附实验时，向预先培养的 A549 细胞单层中每孔加入 100 微升预热的 PBS，轻柔吹打上下混合，清洗三次。然后弃去 PBS。或者，在加入 PBS 后静置十秒钟，再用真空泵吸除 PBS。

为确定细菌结合动力学，将不同感染复数的所需浓度细菌悬液各100微升加入细胞中。离心使细菌沉淀，并将感染的A549细胞在37摄氏度及5%二氧化碳条件下继续孵育1小时。如图所示，用预温的PBS洗涤单层细胞5次，以去除未结合的细菌。

接下来，在冰上向96孔板的每个孔中加入100微升4%多聚甲醛固定细胞。15分钟后，用PBS洗涤3次以去除固定液，并在室温下用50纳克/毫升的DAPI染液对细胞核染色10分钟。

用 PBS 洗涤细胞后，向感染的 A549 细胞中加入 100 微升 PBS 以防止干燥，然后将培养板置于 4 摄氏度避光保存最多两天，或直接进行成像。