一种用于研究细菌感染细胞中钙反应的成像技术

取一个成像培养皿，其中培养了负载有细胞内钙离子荧光指示剂的人类上皮细胞。

加入含有钙离子的培养基。接种致病性细菌Shigella，并进行培养。

细菌分泌系统穿透宿主细胞并释放侵袭效应因子。侵袭会触发肌动蛋白重排，在细菌周围形成细胞膜皱褶。

在入侵位点，质膜上的磷脂酶C（PLC）被激活，内质网（ER）上聚集了三磷酸肌醇受体。

PLC 将膜上的磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸水解为三磷酸肌醇（IP3），由于致密的肌动蛋白网状结构，IP3 在局部积累。

IP3 与内质网上的受体结合，引起钙离子释放。钙离子指示剂与释放的离子结合并发出荧光，显示局部的钙反应。

IP3 通过肌动蛋白缓慢扩散，进一步降低内质网钙水平，并激活质膜钙通道，导致钙离子内流。

细胞内荧光显示全局钙反应延迟。

将含有 Fluo-4 标记细胞的盖玻片置于成像用玻璃底培养皿中。使用 EM 缓冲液洗涤样本三次，以去除可能由细胞裂解产生的化合物。随后加入 1 毫升 EM 缓冲液。将培养皿放置在倒置荧光显微镜载物台上，温度维持在 33 摄氏度。选择一个显微观察视野，并根据需要设置采集参数（如曝光时间和像素合并），以优化 Fluo-4 的荧光信号。

向样品中添加细菌时，小心地从腔室中移除 500 微升 EM 缓冲液，并加入 500 微升细菌悬液，使终末 OD₆₀₀ 达到 0.05。立即开始采集，或等待 10 分钟，使细菌沉降到细胞上。在采集流程结束时，获取所选视野的相差图像，以观察与细胞接触的细菌以及与细菌侵袭位点相关的细胞膜皱褶。

根据图像采集、文件保存以及选择新视野所需的时间间隔，重复采集过程，以覆盖整个流程。在采集过程结束时，向样品中加入 2 µM 钙离子载体离子霉素（ionomycin），以确定钙信号的最大振幅。每 3 至 5 秒采集一次图像，直至信号稳定，通常不超过 10 分钟。

随后加入钙螯合剂EGTA，使其终浓度为10毫摩尔，以测定无钙条件下的荧光信号。每3至5秒采集一次图像，直至信号稳定，通常不超过10分钟。按照文本方案进行图像分析。