利用成像流式细胞术分析人T细胞与SEB负载的Raji细胞之间的免疫突触

取含有未加载的Raji细胞的流式细胞术管 金黄色葡萄球菌 肠毒素B或SEB负载的Raji细胞

这些载有 SEB 的 Raji 细胞可作为替代性抗原提呈 B 细胞，其表面主要组织相容性复合体 II 类分子上结合有超抗原 SEB。

与泛白细胞共同孵育。

T细胞上的T细胞受体（TCRs）与Raji细胞上的SEBs结合，同时在共刺激信号的作用下，形成稳定的细胞间连接结构——免疫突触，从而导致T细胞活化。

这会触发细胞内信号通路，导致肌动蛋白细胞骨架重排，并促使信号分子和细胞表面受体在突触内聚集。

孵育后，固定细胞以保存其细胞结构。对细胞进行通透处理，以便接触细胞内靶标。

加入荧光标记的抗CD3抗体、鬼笔环肽和DAPI，它们分别与TCR复合物中的CD3、肌动蛋白丝和DNA结合。

使用成像流式细胞仪，检测 CD3 和肌动蛋白的荧光信号，以确定在存在 SEB 的情况下它们在突触处的富集情况。 

首先，在50毫升锥形管中将1毫升新鲜采集的人外周血与30毫升ACK裂解缓冲液混合。室温孵育8分钟后，用PBS充满锥形管，进行离心洗涤，并将沉淀重悬于2毫升培养基中，在37摄氏度下孵育60分钟。

孵育结束后，向各FACS管中加入5 × 10⁵个Staphylococcus aureus肠毒素B（SEB）负载或未负载的Raji细胞，细胞悬于500微升培养基中，随后加入650微升泛白细胞悬液。离心共培养物，并将沉淀重悬于150微升新鲜培养基中，在37摄氏度下继续孵育45分钟。

然后，在加入1.5毫升1.5%多聚甲醛的同时，以100 RPM轻轻涡旋振荡细胞10秒。室温孵育10分钟后，加入1毫升含1% BSA的PBS终止固定，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于100微升含BSA和0.1%皂苷的PBS中，并将细胞样品分别加入96孔U型底板的两个独立孔中。

室温孵育15分钟后，离心微孔板，并将沉淀重悬于50微升含BSA和皂苷的PBS中，加入荧光染料标记的抗体或感兴趣的化合物，室温避光孵育30分钟。孵育结束后，用150微升含BSA和皂苷的PBS洗涤细胞三次，再将沉淀重悬于60微升PBS中。

为了通过流式细胞术对细胞进行成像，请打开分析软件，检查液体水平，然后在仪器菜单中点击启动系统。接着点击加载，并在提示时将样本加载到进样口。

在照明选项卡下，将激发激光功率调整至适当的纳米长度。然后，调节通道4和通道11的门控，并调节通道1的区域。

为评估门控和激光功率的调整，将 视图 菜单切换至相应的门控设置，调节门控和激光功率，直至细胞及成对细胞清晰可见。随后，在 文件 采集 选项卡中，设定样本名称、需采集的图像数量以及适用于 CD3 染色的门控参数，然后点击 采集 以开始图像采集。