0 次观看 • 4:45 分钟 • July 8th, 2025
从一只已通过腹腔注射脂多糖以诱导炎症的麻醉小鼠开始。
切开腹部以暴露腹腔。用生理盐水保持器官湿润。经眼后静脉注射罗丹明6G。荧光染料分子进入循环系统，标记白细胞和血小板，以便观察。
现在，将一段带有肠系膜血管的回肠袢暴露于体外。使用预热的生理盐水保持组织湿润，以获得最佳成像效果。在荧光显微镜下，聚焦肠系膜静脉进行活体显微观察。
脂多糖注射可引起内皮细胞活化，导致包括选择素在内的黏附分子上调。循环中的血小板被招募至内皮细胞，并在其表面结合。 通过 特异性黏附分子-配体相互作用，形成黏附复合物。
由于这些相互作用，血小板被激活并释放含有分子（包括5-羟色胺）的颗粒，从而促进白细胞的募集。
白细胞移动至内皮表面并与活化的血小板结合。此外，白细胞通过较弱的黏附相互作用沿内皮滚动并与其细胞结合。滚动运动激活白细胞整合素，使其与内皮细胞牢固黏附，这对白细胞穿越内皮至关重要。
利用活体显微镜观察荧光标记的白细胞和血小板，以确定它们与内皮细胞的实时相互作用。
在活体成像前4小时，向一只16至20克重、4至6周龄的雄性小鼠腹腔注射20毫克/千克的LPS，以诱导模拟细菌性炎症反应。
同时，将0.9%生理盐水溶液在37摄氏度水浴中预热，用于湿润塑料腔室和肠系膜组织。接下来，通过夹捏LPS处理小鼠的脚趾无反应来确认麻醉深度合适，然后在动物眼睛上涂抹眼膏。
使用剃毛器去除腹部毛发，并用浸有70%乙醇的纱布擦去任何松散的毛发。然后，使用小型弯头镊子和剪刀打开腹部。
识别腹上部血管，并在腹白线区域切开腹膜以保护这些血管。向腹腔内加入数滴预热的生理盐水，以保持组织湿润，随后通过眼球后注射50微升罗丹明6G，以标记循环血细胞。然后，将小鼠置于直径10厘米的培养皿中，外置一段回肠，并每隔一分钟给予预热的生理盐水，以保持组织湿润。
为了通过活体显微镜观察炎症反应，将小鼠置于显微镜下，使一条直径为200至300微米且周围脂肪尽可能少的肠系膜静脉进入视野。
使用合适的显微镜软件，在每只小鼠的4条不同静脉中记录血细胞-内皮细胞相互作用1分钟。然后，为分析细胞间反应，请确认血流条件稳定且个体间一致。
为了定量滚动的白细胞数量，需在静脉上画一条垂直线，并手动计数1分钟内通过该线的所有白细胞。为确定滚动速度，需在静脉上画两条相距50微米的垂直线，测量单个白细胞在内皮上稳定滚动时通过两条线之间所需的时间。
为测量白细胞黏附，需在静脉内绘制一个200 × 200微米的正方形区域。随后，手动计数在30秒内于该区域内无可见移动的牢固黏附白细胞。最后，为定量血小板-白细胞相互作用，手动计数结合到单个白细胞上的血小板数量。