结核分枝杆菌 BCG lux 感染接种物的制备与定量

从一管已解冻的Mycobacterium bovis BCG lux菌种开始，该菌株是经基因改造的减毒Mycobacterium bovis，可表达报告基因荧光素酶，具有生物发光特性。

将悬液接种至含有抗生素潮霉素的培养基的培养瓶中。进行培养。BCG lux 携带潮霉素抗性基因，可促进其存活与生长。

孵育后，使用缓冲液在发光仪管中制备合适浓度的培养物稀释液。转移至已装载长链脂肪族醛底物溶液的发光仪中。运行过程中，将醛注入进入分枝杆菌细胞的悬浮液中。

细菌荧光素酶催化内源性还原型黄素单核苷酸和醛的氧化反应，产生蓝绿色光。所测得的生物发光强度反映了BCG lux 的代谢活性，并与活菌数量或菌落形成单位（CFU）的测定值相关。

接下来，离心剩余的分枝杆菌培养物。将分枝杆菌沉淀重悬于含有非离子型表面活性剂的缓冲液中，以防止分枝杆菌聚集。

利用生物发光测量结果，将悬液稀释至所需的细胞密度。对分枝杆菌进行系列稀释，并接种于添加潮霉素的营养琼脂平板上。孵育，使BCG lux 形成菌落。

通过计算CFU以确认其与生物发光强度的相关性。制备的BCG lux 接种物可用于感染研究。

首先，解冻一管冷冻保存的1.2毫升结核分枝杆菌牛型卡介苗Mycobacterium bovis BCG lux甘油菌种。该菌株为蒙特利尔疫苗株，携带含有luxAB基因的穿梭质粒PSMT-1。在已标记的250毫升锥形瓶中，加入15毫升Middlebrook 7H9液体培养基，并接种1.2毫升解冻后的BCG lux菌液。

将烧瓶放入密封的生物安全容器中，在37摄氏度下置于摇床培养箱中以220 RPM振荡培养72小时。培养结束后，在发光检测管中用磷酸盐缓冲液对培养物进行1至10倍系列稀释。涡旋混匀后，将发光检测管装入发光仪中。

将1%正癸醛的无水乙醇溶液加入进样平台，测定生物发光。将生物发光值转换为菌落形成单位，以检测BCG lux 菌株的生长情况。

将培养物转移至离心管中，在室温下以2,175 × g 离心10分钟，使细胞沉淀。将上清液弃入含有已知抗分枝杆菌活性的适当消毒剂中。用50毫升PBS-T将细胞沉淀洗涤两次，每次在2,175 × g 离心10分钟，以防止细菌成团。

最后一次洗涤后，倾去废液上清，用所需体积的 PBS-T 重悬分枝杆菌细胞沉淀，以将分枝杆菌悬液稀释至目标细胞密度。随后，在 24 孔板中用 PBS-T 对接种物进行 10 倍系列稀释。

取10微升每种稀释液，分别涂布于Middlebrook 7H11琼脂平板上，每个稀释度设两个重复，用于测定接种物的菌落形成单位（CFU）数量。