建立昆虫幼虫细菌感染模型的技术

将大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫置于注射平台上，使其腹面朝上。

取一支含有Mycobacterium bovis BCG lux悬液的微量注射器——这是一种经基因改造可产生生物发光的活细菌疫苗株。将该悬液注射至幼虫最后一对腹足（腹部附肢）中，使细菌释放入血淋巴——即体腔内的循环液体。

将幼虫转移至受控环境中进行培养。细菌利用血淋巴作为丰富的营养来源并大量增殖。

血细胞——存在于血淋巴中的无脊椎动物免疫细胞——会聚集在细菌周围，形成类似肉芽肿的结构，以防止感染扩散。血细胞释放前酚氧化酶，该酶经过蛋白水解切割后转化为酚氧化酶。

酚氧化酶合成黑色素，将细菌隔离在感染部位。黑色素沉积导致全身性黑化，使幼虫体色变深。

血细胞将细菌吞噬进入吞噬体。吞噬体与溶酶体融合，获得裂解酶，导致细菌降解。部分细菌可逃避吞噬溶酶体的降解，并在血细胞内存活——从而导致持续性感染。

在规定的时间间隔测量细菌的生物发光。生物发光信号的初始下降表明有效的抗菌反应，而信号值趋于平稳则表明存在持续性感染。

收到购买的龄期幼虫后，置于18摄氏度避光环境中饲养，并在购买后一周内使用。根据均匀的乳白色体色、适当的体型与体重、较高的活动能力，以及翻转后能够自行翻正的能力，鉴定并筛选健康的幼虫用于实验。使用钝头镊子小心地将健康幼虫计数并转移至铺有一层滤纸的培养皿中，于室温避光条件下保存直至使用。

通过将一张直径为94毫米的圆形滤纸固定在平坦的抬高表面上，来准备注射平台。用25微升微量注射器吸取三倍体积的70%乙醇进行灭菌，随后弃去，并再用三倍体积的无菌PBST冲洗。然后重悬制备好的BCG lux 接种物，并将10微升吸入已灭菌的微量注射器中。另取一支注射器吸取PBST作为阴性对照。

经过10次注射后，重悬BCG lux 接种物以确保细胞均匀悬浮。用镊子夹取一只幼虫并放置于注射平台上。在平台上将幼虫翻转至背部朝上，并用镊子固定其头部和尾部以实现固定。从幼虫头部向下计数，定位左侧最后一个腹足，在水平面呈10至20度角的方向上，将针尖小心插入5至6 mm深度。随后从注射器中注入接种物。

每次感染后，将感染的幼虫转移至铺有滤纸的培养皿中。一个直径94毫米的培养皿最多可容纳30只幼虫。将培养皿置于孵育箱内的通风暗盒中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养。

每24小时监测一次幼虫的存活情况。当幼虫对触碰无任何运动反应时，即判定为死亡。记录存活数据，并使用Mantel-Cox检验评估统计学显著性。