使用流式细胞术定量尿路致病性大肠杆菌感染小鼠膀胱组织中的免疫细胞浸润

0 次观看3:43 分钟 • July 8th, 2025

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为了量化尿路致病性大肠杆菌感染的小鼠膀胱组织中的免疫细胞浸润,将切碎的组织放入含有胶原酶和脱氧核糖核酸酶的消化缓冲液中。

定期摇晃孵育以破坏组织。

胶原酶消化组织的细胞外基质,释放细胞。脱氧核糖核酸酶降解干扰游离 DNA。

孵育后,加入含有螯合剂和胎牛血清的缓冲液,以灭活消化酶。

消化的混合物通过过滤器以去除组织碎片和结缔组织,获得单细胞悬液。

细胞离心并重悬于含有 Fc 阻断抗体的缓冲液中。这些抗体与免疫细胞 Fc 受体结合以防止非特异性抗体结合。

添加荧光团标记的抗CD45抗体,该抗体与免疫细胞上的跨膜CD45蛋白结合。

心并将重悬的细胞通过细胞过滤器以去除细胞聚集体。

使用流式细胞仪测量免疫细胞上荧光团偶联抗体的荧光信号,以量化膀胱中的免疫细胞浸润。

要对膀胱组织进行流式细胞术,在如图所示分离膀胱后,用剪刀将组织切碎。每管加入1个切碎的膀胱,每管含有消化缓冲液,然后,摇动管子以洗涤消化缓冲液中的切碎组织,并将其保持在冰上,直到所有膀胱都被解剖并切碎。将切碎的膀胱在37摄氏度下孵育60至75分钟,每15分钟用手剧烈摇晃5秒。

当组织具有类似于湿纸巾的玻璃状透明外观时,消化就完成了。通过加入 2 至 3 毫升冰冷流式细胞术缓冲液灭活消化酶,并轻轻混合。然后,将试管放在冰上。

为确保单细胞悬浮液并去除任何结缔组织,请将试管中的内容物通过放置在 15 毫升锥形管中的 100 微米过滤器。然后,用注射器柱塞的末端,轻轻地将任何剩余的组织压过过滤器。用额外的 2 毫升流式细胞术缓冲液清洗过滤器,并将样品放在冰上。然后,在4摄氏度下以200倍g离心洗涤样品7分钟。

将沉淀重悬于 100 微升流式细胞术缓冲液中,其中含有稀释至每毫升 5 微克的 Fc 块,然后转移到 96 孔圆底板中。10 至 15 分钟后,向每个样品中加入 100 微升所需的抗体混合物。然后,将样品在避光的冰上孵育30至45分钟。通过在4摄氏度下以200倍g离心洗涤样品7分钟。

最后,将细胞沉淀重悬于 200 微升流式细胞术缓冲液中,并在流式细胞仪上采集之前将样品通过 5 毫升聚苯乙烯管上的 40 微米细胞过滤器。

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最后更新:1 八月 2026